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线虫模型在科凯恩综合征之神经退行性变研究中的应用

2023-06-06 11:25



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科凯恩综合征(Cockayne syndrome,简称CS)是一种罕见的常染色体隐性遗传病,于1936年首次由英国医生科凯恩博士报道而得名。

CS患者中观察到的临床特征包括:皮肤光敏性、发育迟缓、皮下脂肪减少、听力和视力丧失、恶病质侏儒症、弯腰姿势和进行性神经退行性变。该病全球发病率为每百万出生人口就有2.5例,它是由两个基因突变ERCC8(称为CSA),ERCC6(称为CSB)产生的,其突变的致病率分别占CS病例的20%和80%。该病患者的平均死亡年龄为8.4岁(B.T.W.,未发表的数据),很少患者能存活超过30岁。据报道,科凯恩综合征患者接受甲硝唑治疗时,有严重的肝毒性,产生急性肝衰竭,甚至死亡。虽然CSA和CSB在核苷酸切除修复(nucleotide excision repair,简称NER)中的作用已经被深入研究,但与其功能障碍相关的多效性表型以及症状背后的细胞和分子缺陷仍然知之甚少。因此,在分子水平上破译CS将有助于进一步了解其潜在的病理和正常衰老的机制。

目前研究CS的系统包括CSA小鼠模型及CSB小鼠模型,前者概括了人类对紫外线敏感性的临床特征,而后者除了对紫外线敏感性外,还显示内耳螺旋神经节细胞丢失和恶病性侏儒症的表型特征。然而,Csa-Csb-缺陷小鼠表现出明显的皮肤癌易感性,这在人类CS病例中没有发现,并且没有表现出任何明显的解剖异常。虽然对老鼠的研究有助于理解在人类中观察到的临床特征,但在哺乳动物中观察到的表型多样性,使得我们有必要建立一个简单的全生物体模型系统。

CSA和CSB蛋白在整个进化过程中都很保守,基因的突变在秀丽隐杆线虫也有相关研究描述。携带csa-1csb-1突变的线虫,在紫外线处理后显示出发育生长迟缓和寿命缩短的表型。鉴于紫外线诱导的线虫表型和CS患者的类早衰病理之间的相似性,在本次分享的文章中作者试图通过秀丽隐杆线虫模型再现神经退行性表型。




csb-1突变体

线虫呈现体细胞组织功能降低

CS患者表现出许多行为、认知和知觉异常,包括眼部异常、感音神经性听力损失和步态紊乱。作者使用csb-1缺陷的秀丽隐杆线虫来评估成年动物有丝分裂后体细胞组织在紫外线处理下可能存在的行为缺陷。咽部泵送速率是体细胞组织功能的一个敏感参数,与野生型(wt)线虫相比,csb-1突变线虫成虫第2天的咽泵率降低,这一现象经紫外线照射后加重。在CSB-1启动子的控制下异位表达wt CSB-1蛋白的转基因线虫株,缓解了咽泵缺陷症状(见图1)。

图1  野生型和突变型线虫在紫外线照射前后的咽泵速率变化

另外,csb-1突变体的平均运动速度也显著降低,紫外线照射后,其运动功能障碍明显增加。在趋化性试验中,大多数wt线虫株在30 min内会趋向于趋化剂,而csb-1突变体则长期停留在平板的中间区域,这种现象表明csb-1化学感觉功能的丧失。同样地,表达wt CSB-1蛋白的转基因线虫株,其运动、感觉功能丧失的症状得以抑制(见图2-3)。csb-1缺陷的线虫表现出行为改变,表明了其神经元功能障碍。

图2  野生型和突变型线虫在紫外线照射前后的运动速率变化

图3  野生型和突变型线虫在紫外线照射前后的趋化性差异




csb-1突变体

具有机械感觉神经元功能缺陷

CS患者还表现出进行性神经功能障碍症状,以髓鞘异常、脑萎缩和小头畸形为主要特征。为了研究缺乏CSB-1的线虫是否表现出神经退行性变的迹象,作者检测了由机械感觉神经元、后侧微管细胞(PLM)、前外侧微管细胞(ALM)和后腹侧微管细胞(PVM)介导的温和触摸反应。与野生型线虫相比,csb-1突变体表现出加速的年龄依赖性的触摸敏感性丧失。紫外线处理加剧了年龄依赖的触摸不敏感性,表明DNA损伤可加快神经元功能的丧失(见图4)。

图4 在线虫前部(ALM神经元)和后部(PLM神经元)进行温和的触摸反应检测

为探究csb-1突变株对温和的机械感觉刺激的敏感性较低的原因,作者利用双突变体zdls5[mec-4::GFP+lin-15(+)] I;csb-1(ok2335)进行神经元轴突完整性分析。通过延时实验表明,在数小时的过程中,神经元的串珠作用会随着轴突的变薄而加重,直到它导致轴突的断裂,即产生神经退行性变(见图5)。

图5  表达pmec-4::GFP线虫随时间依赖的神经元轴突变性程度




csb-1缺失

会导致功能失调的线粒体的积累

据文献报道,CS患者的神经系统缺陷可能与线粒体功能障碍有关。因此,作者使用zcls14[myo-3::GFP(mit)]和zcls17[ges-1::GFP(mit)]线虫株,分别在肌肉和肠道特异性启动子的控制下表达线粒体靶向序列,以观察线虫组织中的线粒体含量。与wt相比,csb-1突变体在成年期第1天和第3天的线粒体GFP水平显著升高,而在第5天,肠道荧光情况却发生逆转(见图6)。

图6  不同日龄的野生型和突变型线虫肌肉、肠道荧光表达情况

(E、F图分别是对肌肉和肠道荧光表达进行的量化)

csb-1突变株中两种组织特异性线粒体GFP转基因株系的线粒体含量水平均较高,提示线粒体的周转可能受到损害,表明受损线粒体的积累。为证实这一想法,利用TMRE检测活性线粒体的水平,尽管csb-1突变体的线粒体含量较高,但它们在成年期第1天表现出相似的线粒体活性水平。在UV处理后,csb-1突变体的活性线粒体水平显著降低,但在突变体中表达wt CSB-1可挽救该情况(见图7)。

图7  野生型和突变型线虫的线粒体活性水平变化

综上所述,csb-1突变体的线虫表现出多种线粒体缺陷和呼吸活动受损表型,并伴有神经元变性。这与内源性DNA损伤修复缺陷导致的异常情况相一致,线粒体缺陷和神经退行性表型在紫外线照射下均显著加重。



作者建立的关于秀丽隐杆线虫csb-1突变体的神经元变性和线粒体畸变的CS模型,可以填补人类复杂的CS病理和缺乏能反映表型疾病表现的实验上可追踪的后生动物体内模型之间的重要实验空白(见表1)。因此,CS线虫模型不仅可以很容易地用于机制、生理和遗传学研究,还可以用于识别和表征可能改善线粒体网络失衡和防止神经退行性变的药物干预。秀丽隐杆线虫CS模型可能为DNA损伤在年龄相关的神经元完整性逐渐丧失中的因果作用提供重要的新见解,并为神经退行性疾病提供一个实验模型。

表1  CSB缺陷模型的特征比较

撰稿:郑惠

审核:陈岚彬

编辑:刘乐丰