蓝色荧光——新的衰老研究生物标记物

近年来衰老一直是研究的热门话题，其中，晚期糖基化终产物（AGEs）引起了科学界的关注^[1]。AGEs是由还原糖和蛋白质、脂质或核酸中的氨基之间的非酶反应（Maillard美拉德反应）形成的复杂化合物，它在糖尿病患者体内大量形成，但也在动物的生理衰老过程中形成，并导致氧化应激^[2,3]。线虫是优秀的衰老研究模型，它的平均寿命在21天，1到3日龄属于幼虫期，4日龄后属于成虫期直至衰老，线虫体内AGEs的含量与其预期寿命具有强相关性。现有的研究有用脂褐素发出的红色荧光作为生物标记来研究衰老^[4]，但是这个红色标记一般只适用于老龄的线虫（大于13日龄），因此寻求一个在衰老早期就能运用的荧光生物标记变得尤为重要。来自日本的Tomomi Komura、Mikihiro Yamanaka等人阐明了一种蓝色荧光与AGEs的相关性，将该自发的蓝色整理为一种可以评估自发荧光作为秀丽隐杆线虫衰老的非侵入性生物标记物，适用于线虫的各个生长时期。进一步验证了线虫可作为寻找抗衰老因子、研究晚期糖基化终末产物与衰老关系的新模型。

作者提取了线虫的蛋白，通过荧光光谱测定法分析发现17日龄（老年线虫）线虫的自发蓝色荧光要显著高于3日龄（年轻线虫）线虫（见图1a），并且随着年龄的增长，蓝色荧光的强度也一直上升（见图1b）。由于已知一些AGE化合物具有自身荧光，作者使用了一种抗Nε-（羧甲基）赖氨酸（CML）的抗体（AGE化合物的代表）[5]进行了免疫印迹实验，以此来检测AGE含量与蓝色荧光之间的关系。结果是随着线虫日龄时间的推移，衰老化合物CML越来越多（见图1c），同时蓝色荧光强度也是逐渐上升（见图1d）。这里说明线虫的蛋白蓝色荧光与AGE代表化合物具有关联性，蓝色荧光强度与AGEs均伴随着衰老逐渐增多。

图1 线虫蛋白样品的荧光分光光度法及AGEs测定

为了进一步研究线虫自发蓝色荧光是否与非酶的糖基化有关，作者将提取的蛋白分别和葡萄糖、核糖和果糖孵育了4周并设置无糖作为对照。结果显示，在糖存在的情况下，蓝色荧光随着时间的推移而增加（见图2a），尤其是核糖（见图2b）。即使在体外，线虫蛋白也可以通过糖基化获得荧光。为了直接评估糖基化的蛋白荧光的增加是否与代表性的AGE化合物CML的形成有关，作者进行了ELISA实验。结果发现与不含糖孵育4周的对照组相比，核糖孵育下的CML水平高达7倍（见图2b）。这也说明了蛋白中自发的蓝色荧光和衰老中的AGEs高度相关。

图2 线虫体外糖基化后提取蛋白的蓝色荧光和AGEs

作者接着对线虫直接进行荧光光谱分析，结果和提取的蛋白呈现一样的规律，4只13日龄的衰老线虫在相似的波长处发现了最高的荧光（见图3a），从3日龄到13日龄荧光强度也随时间变化呈现上升趋势（见图3b）。但是，有研究表明蓝色荧光和死亡高度相关^[6,7]，为了确定自发的蓝色荧光是贯穿整个衰老过程而不是死亡这么一个因素所致，作者首先对老年（13日龄）线虫进行蓝色荧光和日龄增长的相关性实验。结果发现，随着时间的推移，蓝色荧光和线虫的寿命是负相关的（见图3c）。

图3 测定单个线虫的荧光分光光度

接着作者用含有核糖的培养基培养线虫，相较于对照组，线虫蓝色荧光强度会升高的同时寿命反而是下降了（见图4a，b）。此外，通过设置利福平（AGEs阻断剂）和daf-2突变（延长寿命）两个阻碍AGEs的变量进行了实验，结果相较于对照组，实验组的自发蓝色荧光强度都是更低的（见图4c，d）。

图4 AGEs阻断剂和延长寿命的突变daf-2对单个线虫自发蓝色荧光的影响

据报道，死亡前后数小时的蓝色荧光是由邻氨基苯甲酸发出的。邻氨基苯甲酸通过犬尿氨酸途径糖基化形式发出蓝色荧光^[8]，因此作者突变了kynu-1基因得到了缺乏犬尿氨酸酶的线虫，该突变体线虫预计不会发出死亡荧光。然而在突变存在的情况下，衰老线虫仍然比年轻线虫发出更高的荧光（见图5a）。并且添加核糖的线虫表现出显著高于无糖培养线虫的自发荧光（见图5b），这也说明蓝色荧光是贯穿线虫生命周期而非只是线虫死亡期间。用核糖维持的线虫寿命明显短于其他实验组，表明AGEs在线虫中的促衰老作用（见图5c）。

图5 来自kynu-1突变体的蓝色荧光

（排除邻氨基苯甲酸死亡荧光干扰）

为了确定发出蓝色荧光的具体物质，作者通过LCMALDI检测从提取的线虫蛋白中拟定了六种最丰富的蛋白。高分辨率质谱分析显示，老年线虫的卵黄蛋白含量是年轻线虫的六倍以上。糖化卵黄原发出的荧光光谱与17日龄线虫中提取的粗提物获得的光谱相似（见图6a），在体外培养的23天，糖化的卵黄原蛋白和对照组延长因子的荧光分别是非糖化蛋白的6倍和3倍（见图6b）。将卵黄蛋白通过蛋白凝胶成像，卵黄蛋白原YP170和YP115两个条带被分离出来，通过抗-CML抗体的免疫印迹实验，两个条带也是清晰明显的（见图6c）。通过数据分析，伴随着线虫衰老，卵黄蛋白原YP170也是持续上升，并且糖基化卵黄蛋白原YP170也要显著高于未糖化的，这也说明糖基化的卵黄蛋白原YP170为衰老动物中的发出蓝色荧光的主要物质（见图6d）。

图6 卵黄原蛋白（Vit）和延伸因子（EF）的自体荧光

作者将线虫自发蓝色荧光作为秀丽隐杆线虫衰老的非侵入性生物标记物，使用荧光光谱测定法测量了个体线虫的自发蓝色荧光。线虫自体的荧光强度随年龄增长而增加，荧光强度越低的动物寿命越长。当从线虫中提取的蛋白质与糖孵育时，随着时间的推移，晚期糖基化终末产物（AGEs）的荧光强度和浓度逐渐增加。核糖的糖基化作用不仅在体外而且在体内都增强了这些变化，糖基化阻断剂利福平抑制了荧光的这种上升。高分辨率质谱分析显示，卵黄原蛋白在老年线虫体内聚集，糖基化的卵黄原蛋白比未糖化的卵黄原蛋白释放出高6倍的荧光。随着年龄的增长，蓝色荧光的增加来源于糖化物质，因此可以作为一种有效无创的AGEs生物标记物。进一步验证了线虫可作为寻找抗衰老因子、研究晚期糖基化终末产物与衰老关系的新模型。