给对象拍照有什么难的？你来试一试给线虫拍个美照？关于线虫荧光表达方面超实用的分享！我不允许你还不知道。
每个人的相册都有很多照片，每一张照片，都是我们的生活轨迹，这些照片记录着每个阶段我们的变化，我们的成长。线虫科研也离不开照片的记录，科研工作者需要用照片记录线虫各实验阶段的特征，最常见的就是拍摄表达荧光蛋白的线虫照片，以此来证明荧光蛋白的存在或追踪目的荧光的表达。秀丽隐杆线虫作为一种模式生物，具有虫体小（成虫只有1mm左右）、全身透明等特点，这使得其在显微镜下很容易被追踪到一些细胞和组织，也能观察到荧光的表达位置和表达强度。
上源生科是一家专门做线虫相关服务的生物公司，因为可利用荧光蛋白标记活体细胞，所以在我们的基因编辑定制服务中，经常能见到一些荧光蛋白的标记，例如绿色荧光蛋白GFP、mNeonGreen等和红色荧光蛋白mCherry、wrmScarlet等。上源成立至今已完成数千株突变体的构建，我们总结了历年来关于荧光蛋白的插入服务，统计出常见受欢迎的荧光蛋白有GFP，mNeonGreen，mcherry，wrmscarlet，mKate，tagRFP，DsRed，YFP，mOrange，Dendra2，BFP，CFP等。
在线虫中，荧光表达的颜色由蛋白编码序列决定，荧光表达位置则由启动子决定，在此我们以绿色荧光蛋白GFP的表达来举几个例子：
myo-2启动子启动的头咽部表达
（Pmyo-2::GFP）
图1 头咽部表达绿色荧光蛋白的线虫
sur-5启动子启动的周身表达
（Psur-5::sur-5::NLS::GFP）
图2 周身表达绿色荧光蛋白的线虫
myo-3启动子启动的体壁肌肉表达
（Pmyo-3::GFP）
图3 肌肉表达绿色荧光蛋白的线虫
rab-3启动子启动的泛神经元表达
（Prab-3::GFP）
图4 神经元表达绿色荧光蛋白的线虫
那么，我们如何拍摄出如上图一样好的荧光表达图片呢？
1、准备载玻片和盖玻片，玻片务必干净，否则杂质会影响观察。
2、使用3%的琼脂糖溶液制作琼脂垫，作为线虫的保湿载体。琼脂垫必须厚度均一，无气泡，无杂质。
4、挑取适量线虫，在琼脂垫上滴加3-5μL浓度为50mM的叠氮钠，将线虫放在叠氮钠中，显微镜观察等待线虫出现麻痹状态。
5、盖上盖玻片，如果想要拍摄的线虫视野单一且更加好看，可以多加一点叠氮钠溶液，使线虫尽可能分离开。盖上盖玻片，尽量不要产生气泡。
然后就是打开相差显微镜，开始拍照啦。具体拍摄步骤和参数设置，有需要的伙伴可以私聊我们哦，主打就是一个熟能生巧，大家多多操作就能拍出漂亮的线虫图片啦。
接下来分享我们公司收到的一个客户反馈实例
在定制某个特定基因插入荧光蛋白GFP的服务中，我们利用CRISPR Cas9基因编辑系统顺利得到了所需的纯合突变体，但是通过显微镜观察纯合线虫，却发现看不到绿色荧光的表达，这时你是不是开始慌了？先别急！这是有概率发生的现象，大致有以下几点可能的原因：
（1）观察的线虫时期不正确，某些基因只在特定的线虫生长时期表达。
（2）蛋白表达量较低，以至于在显微镜下观察不到荧光。
（3）目的蛋白和荧光蛋白融合表达时，荧光蛋白影响了目的蛋白的折叠导致折叠错误，从而在显微镜下观察不到荧光。
……
所以荧光不亮不代表没有荧光蛋白编码序列的插入哦。编辑位置如下图所示，建议设计GFP插入段特异性引物进行扩增，或在两端基因组序列里设计包含整个GFP插入段的上下游引物，扩增后送测，比对测序结果后判断GFP插入是否完整、插入位置是否精确、是否为单拷贝。以上验证没问题的话，虽然荧光不表达或难以观察到，但是也可证实突变体是存在的，基因编辑是成功的。
知识小拓展
我们通常用配有荧光光源的相差显微镜拍摄线虫荧光表达图片，如果需要做分类鉴定，对图片分辨率要求较高且需要展示立体成像功能的，则需用到激光共聚焦显微镜，其主要特点如下：
（1）分辨率高，去除杂散光，荧光效果更好、更精确。
（2）能显示立体的3D图像及切面图。
（3）更完美的细节，兼顾活细胞成像等。
以下是小编用激光共聚焦显微镜Leica TCS SP8和微分干涉显微镜Imager M2拍摄的线虫头部多巴胺神经元图片，大家可以清晰地看到两种显微镜在成像方面的对比。关于激光共聚焦显微镜的用处和特点，我们简单介绍到这里。如果需要进一步了解或者需要委托我们提供相关服务，欢迎私聊我们小编哦。
共聚焦显微镜Leica TCS SP8（左）和微分干涉显微镜Imager M2（右）镜头下的多巴胺神经元
撰稿：李亚南 袁巧红
审核：赵培 陈岚彬
编辑：刘乐丰
