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CRISPR基因编辑技术自2012年作为基因编辑工具被广泛应用以来,已经成为生命科学领域最受瞩目的科学突破之一。这项技术利用向导RNA(sgRNA)引导Cas酶精确定位并切割特定DNA序列,从而实现基因的添加、删除或替换。CRISPR技术以其独特的机制、高效的编辑能力以及广泛的应用前景,在全球范围内受到了研究人员和研究机构的高度关注。本文将概述CRISPR基因编辑技术的最新进展,包括其在不同领域的应用和未来可能的发展方向。
一、医疗领域
1. 神经系统疾病
帕金森病是一种神经退行性疾病。通过编辑胚胎干细胞和患者衍生的干细胞,研究人员正在开发个性化的细胞疗法。通过增强如Persephin(PSP)和胰岛素样生长因子1 (IGF-1)等神经保护蛋白的表达,可以改善多巴胺能神经元的存活率和神经发生。利用CRISPR/Cas9技术,研究人员可构建帕金森病疾病模型,进一步筛选潜在的治疗物质。此外,最新的研究进展显示,CRISPR/Cas9筛选技术在神经干细胞(NSCs)衰老研究中取得了重要发现。研究团队通过体内外筛选实验,发现了葡萄糖转运蛋白GLUT4(由Slc2a4基因编码)在NSCs衰老过程中发挥了关键作用。老年NSCs中GLUT4的表达显著增加,导致葡萄糖摄取能力增强。敲除Slc2a4可以显著提高老年NSCs的激活效率,验证了GLUT4在NSCs衰老中的关键作用[1]。
2. 遗传病治疗
CRISPR/Cas9技术在遗传病治疗领域展现出巨大的潜力。许多遗传病主要由单个基因的突变引起,传统的治疗方法往往难以根治。通过CRISPR/Cas9技术,研究者有望直接纠正致病基因突变,从而达到治疗目的。例如,对于囊性纤维化、亨廷顿症、β-地中海贫血等遗传病,研究者已在动物模型中成功实现了基因矫正,显示出良好的治疗效果[3],虽然这些治疗仍处于临床前或早期临床阶段。值得一提的是,2023年底,美国FDA批准了首款基于CRISPR的基因编辑疗法Casgevy上市,用于治疗镰状细胞病(SCD)。2024年初,Casgevy被批准用于治疗12岁及以上输血依赖性β-地中海贫血(TDT)[2,5]。
3. 肿瘤学研究
CRISPR/Cas9筛选技术在肿瘤学领域的应用已经取得了显著进展,特别是在识别肿瘤弱点、优化嵌合抗原受体T细胞免疫疗法,以及解释肿瘤免疫逃逸机制方面。通过构建全基因组敲除文库,研究者可以系统地鉴定出驱动癌症发生发展的关键基因。例如,研究者可以通过CRISPR/Cas9技术在肿瘤细胞中进行基因敲除,筛选出对肿瘤生长和转移至关重要的基因。这些基因可以作为潜在的治疗靶点,为开发新型抗癌药物提供重要线索[10]。
4. 抗菌应用
抗细菌药物耐药性对现代医疗系统构成了重大挑战,开发解决这一问题的治疗策略至关重要。CRISPR/Cas系统,作为一种细菌适应性免疫系统,可以选择性地靶向和破坏细菌基因组。研究人员通过将CRISPR/Cas3和CRISPR/Cas9基因组编辑构建体包装成噬菌体,可以实现抗微生物耐药(AMR)基因特异性的细菌杀伤,以预防AMR基因的传播。CRISPR技术还可以用于快速、准确地检测耐药菌株,增强感染控制措施。通过整合基因组学、CRISPR技术和新型疗法,可以开发出更高效的策略来应对AMR危机,保护公共健康[4,13]。
5. 临床应用
2023年10月18日,美国食品药品管理局(FDA)批准了Intellia Therapeutics公司用于治疗转甲状腺素(ATTR)淀粉样变性伴心肌病的NTLA-2001的新药临床试验(IND)申请。NTLA-2001通过脂质纳米颗粒(LNP)递送系统,将靶向TTR基因的CRISPR基因编辑系统传递到肝脏中,特异性敲除TTR基因,从而降低TTR蛋白的表达。在1期临床试验中,NTLA-2001显示出积极的初步结果。接下来,Intellia Therapeutics将开展名为MAGNITUDE的大规模3期研究,以进一步评估NTLA-2001的疗效和安全性。
上海本导基因开展了全球首例CRISPR抗病毒治疗的临床研究,该公司首创的体内基因编辑抗病毒药物BD111的Ⅰ期临床试验已顺利完成首例受试者的给药。BD111注射液利用类病毒体(VLP)技术递送CRISPR基因编辑工具,直接靶向切割1型单纯疱疹病毒(HSV-1)的基因组,从而抑制病毒的复制,甚至可能实现病毒清除。这种新型治疗方法被认为有望根治单纯疱疹病毒型角膜炎,且已获得中国国家药品监督管理局(NMPA)和FDA的新药临床试验批件,并获得FDA孤儿药资格。这是全球首个采用CRISPR体内基因编辑技术治疗病毒性疾病的重要里程碑事件。
辉大基因宣布美国FDA已批准其用于治疗新生血管性年龄相关性黄斑变性(nAMD)的HG202新药临床试验(IND)申请,这是首个临床阶段的CRISPR/Cas13 RNA编辑疗法,也是唯一一个临床阶段的RNA靶向疗法,用于治疗nAMD。相比于传统的RNA干扰技术,Cas13系统具有更高的敲低效率和特异性;与Cas9介导的DNA编辑技术相比,Cas13不会对基因组造成永久性改变,甚至可以通过药物来调控RNA编辑,使其具有可逆性,因此在疾病治疗上具有比较独特的优势。
二、农业生物技术领域
CRISPR/Cas9技术在农业生物技术领域同样具有广阔应用前景,特别是在作物改良、抗病性、抗虫性、耐旱等方面。转座酶辅助靶点整合技术(TATSI)是一种新型植物基因组工程工具,它将水稻的Pong转座酶蛋白与CRISPR相关的可编程核酸酶(如Cas9或Cas12a)结合,能够精准控制基因的插入位点和携带的DNA片段,从而实现高效的基因组编辑。通过基因编辑技术,研究者可以对作物的基因进行精确修改,培育出具有抗病、抗虫、耐旱等优良性状的新品种。例如,研究者已经利用CRISPR/Cas9技术成功培育出抗稻瘟病的水稻品种,显著提高了水稻的产量和品质[6]。
三、合成微生物领域
基因编辑技术能够改变微生物群落的组成和功能,从而在废物管理、药品生产和生物燃料开发等领域实现优化。在生物修复领域,基因编辑技术可以用来设计合成微生物群落,使其能够有效减少水或土壤中的重金属污染。在合成微生物群落的设计中,CRISPR技术被用来精确编辑基因组,构建生物遗传电路,直接影响代谢途径,从而重新设计生物系统并控制它们的行为。例如在大肠杆菌和拟杆菌中针对特定基因(如大肠杆菌中的lacZ和拟杆菌中的BT2086)进行编辑,研究人员成功实现了不干扰整体微生物群落的物种特异性编辑。CRISPR技术显著增强了合成微生物群落的代谢工程策略设计和实施,为生物医学、生物修复和工业领域的创新应用提供了可能[15]。
四、基础生物学研究
CRISPR/Cas9技术在基础生物学研究中的应用也非常广泛,尤其在基因功能研究、发育生物学、代谢、免疫等领域取得了显著进展。通过基因编辑技术,研究者可以精确地敲除或敲入特定基因,研究这些基因在细胞和生物体中的功能。例如,研究者可以利用CRISPR/Cas9技术在模式生物(如小鼠、斑马鱼等)中进行基因功能研究,揭示基因在发育、代谢、免疫等生物学过程中的作用[9]。其中,利用CRISPR技术进行线粒体基因组编辑是一个新兴且充满潜力的领域。研究者们开发了一种名为mito-Cas9的系统,通过在线粒体靶向序列和核编码线粒体基因的3'非翻译区上游和下游添加序列,成功将Cas9蛋白导入线粒体中[7]。然而,将sgRNA导入线粒体是该技术需要攻克的难题。为了提高导入效率,研究者们探索了多种策略,包括使用线粒体靶向序列(MTS)和茎环结构。这些结构可以帮助sgRNA通过病毒载体如AAVs或工程化的病毒样颗粒(eVLPs)被导入线粒体。这些技术的进步为治疗由线粒体DNA突变引发的疾病开辟了新途径。
五、CRISPR技术的发展和未来
CRISPR基因编辑技术发展至今,新兴技术与方法的探索从未停止。
为解决CRISPR/Cas9系统可能引发的脱靶效应问题,研究人员通过蛋白工程技术开发了高保真(Hi-Fi) CRISPR系统。该系统通过改良Cas9蛋白结构显著降低了非目标DNA位点的切割,从而提高了基因编辑的特异性。
2023年,张锋团队在真核生物中发现了一种新型的RNA引导的DNA核酸酶——Fanzor,这是一种具有CRISPR样结构的系统,可以在重编程后实现对人类基因组的编辑。Fanzor系统紧凑,更容易递送到细胞和组织中,且没有旁系切割活性,可实现更精准的基因组编辑[8]。
中国科学院遗传与发育生物学研究所高彩霞研究组利用AI技术开发新型碱基编辑工具。该研究创新性地运用AI辅助的大规模蛋白结构预测,建立起全新的基于三级结构的高通量蛋白聚类方法,实现了脱氨酶功能结构的深入挖掘,开发了一系列新型碱基编辑系统,并在动、植物细胞中进行了测试[11]。
基因组编辑中的新兴技术让CRISPR工具箱不断扩展,LNP、VLP等递送工具的开发,以及微型化CRISPR系统的发现,让体内基因编辑快速发展。尽管CRISPR技术在基因编辑领域取得了显著进展,但仍存在一些限制,例如目标位点的选择、sgRNA的设计、Cas系统的活性、DNA修复机制的效率、脱靶活动的频率以及分析方法[14]。此外,用于编辑人类胚胎的CRISPR技术,引发了伦理和监管问题。这些问题尚未得到解决,并且随着技术的发展,这些问题可能会变得更加复杂。不过CRISPR技术如今已经在医学、农业和生物技术领域发挥重要作用,相信在未来这项革命性技术将为人类带来更多的福祉。
参考文献
1. Ruetz TJ, Pogson AN, Kashiwagi CM, et al. CRISPR-Cas9 screens reveal regulators of ageing in neural stem cells. Nature. 2024 Oct;634(8036):1150-1159.
2. Parums DV. Editorial: First Regulatory Approvals for CRISPR-Cas9 Therapeutic Gene Editing for Sickle Cell Disease and Transfusion-Dependent β-Thalassemia. Med Sci Monit. 2024 Mar 1;30:e944204.
3. Laurent M, Geoffroy M, Pavani G, et al. CRISPR-Based Gene Therapies: From Preclinical to Clinical Treatments. Cells. 2024 May 8;13(10):800.
4. Niu G, Li W. Next-Generation Drug Discovery to Combat Antimicrobial Resistance. Trends Biochem Sci. 2019 Nov;44(11):961-972.
5. Singh A, Irfan H, Fatima E, et al. Revolutionary breakthrough: FDA approves CASGEVY, the first CRISPR/Cas9 gene therapy for sickle cell disease. Ann Med Surg (Lond). 2024 May 15;86(8):4555-4559.
6. Zhang Y, Lin XF, Li L,et al. CRISPR/Cas9-mediated knockout of Bsr-d1 enhances the blast resistance of rice in Northeast China. Plant Cell Rep. 2024 Mar 18;43(4):100.
7. Kar B, Castillo SR, Sabharwal A, et al. Mitochondrial Base Editing: Recent Advances towards Therapeutic Opportunities. Int J Mol Sci. 2023 Mar 18;24(6):5798.
8. Saito M, Xu P, Faure G,et al. Fanzor is a eukaryotic programmable RNA-guided endonuclease. Nature. 2023 Aug;620(7974):660-668.
9. Chancellor D, Barrett D, Nguyen-Jatkoe L, et al. The state of cell and gene therapy in 2023. Mol Ther. 2023 Dec 6;31(12):3376-3388.
10. Pacesa M, Pelea O, Jinek M. Past, present, and future of CRISPR genome editing technologies. Cell. 2024 Feb 29;187(5):1076-1100.
11. Huang J, Lin Q, Fei H, et al. Discovery of deaminase functions by structure-based protein clustering. Cell. 2023 Jul 20;186(15):3182-3195.
12. Hillary VE, Ceasar SA. A Review on the Mechanism and Applications of CRISPR/Cas9/Cas12/Cas13/Cas14 Proteins Utilized for Genome Engineering. Mol Biotechnol. 2023 Mar;65(3):311-325.
13. Walker-Sünderhauf D, Klümper U, Pursey E, Westra ER, Gaze WH, van Houte S. Removal of AMR plasmids using a mobile, broad host-range CRISPR-Cas9 delivery tool. Microbiology (Reading). 2023 May;169(5):001334.
14. Wang JY, Doudna JA. CRISPR technology: A decade of genome editing is only the beginning. Science. 2023 Jan 20;379(6629):eadd8643.
15. Contreras-Salgado EA, Sánchez-Morán AG, Rodríguez-Preciado SY, et al. Multifaceted Applications of Synthetic Microbial Communities: Advances in Biomedicine, Bioremediation, and Industry. Microbiol. Res. 2024, 15, 1709-1727.
撰稿:徐林婷
审核:陈岚彬
编辑:余雯