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突破!上源生科精准敲除43kb线虫基因组DNA

2019-08-20 20:19

基因敲除

基因敲除是一种重要的基因组编辑技术,当一个生物体的基因被删除时,对它表型的观察可以揭示该基因在生物体中所扮演的角色,在生命活动中起的的作用,更进一步揭示其在人类疾病中的作用。目前,上源生科通过CRISPR/Cas9系统,可以有效地实现长达43,000 bp的线虫基因组敲除。

与传统RNA干扰(RNAi)相比,基因敲除克服了RNAi过程中的脱靶效应;同时由于基因敲除改变了基因组序列,可以得到稳定遗传的突变体,具有RNAi技术无可比拟的高效率;并且,通过基因敲除得到的特定基因的突变线虫还可与其他基因的突变线虫进行杂交而获得双突变甚至多突变的线虫品系,因此,可用于多个蛋白质相互作用的研究,极大的促进了相关功能基因的研究发展。


我们的优势

CRISPR-Cas9系统原理简单,关键影响因素取决于Cas9蛋白,sgRNA 和模板 DNA,其中每个步骤的准确性和效率都会影响基因编辑的结果。尤其对于如何精确地进行大片段的核苷酸敲除一直是基因编辑过程中面临的巨大挑战。

上源生科利用线虫的遗传学优势,对CRISPR/Cas9系统在线虫上的应用做了诸多改良,力求更高效地获取所需要的突变体。目前我们总共完成了206个基因敲除型订单,成功率为100%。其中18个为大片段敲除(5000bp-43,000bp)订单,各长度敲除订单的个数详见表1。

表1 上源生科基因敲除片段的长度、个数及其成功率

敲除片段长度(bp)

订单数

成功率

≤5,000

188

100%

5,000-12,000

11

100%

12,000-20,000

3

100%

30,000-43,000

4

100%

 

特别值得关注的是,最近我司使用CRISPR/Cas9基因编辑系统,成功地将秀丽隐杆线虫ptp-3基因完全删除,敲除片段长度为43kb (参见图1) 。利用一对结合位置在敲除序列以外的引物,以及一对在敲除序列内外都结合的引物,我们确定筛选得到的敲除线虫为纯合子,通过测序确认为精确的ptp-3全基因敲除。为了防止被切下的43kbDNA形成游离的阵列存在与基因组中,我们设计了一对完全结合在被删除序列上的引物,确定筛选到的纯合敲除线虫基因组中不含被删除的DNA序列形成的阵列。

1122222.jpg                                               

图1 ptp-3全基因敲除线虫鉴定图

A: ptp-3基因模式图,其中黑色方块表示的是外显子,黑线表示的是内含子,鉴定引物在基因组中的结合位置已标注。

B: KO-S & KO-A引物对鉴定纯合突变体胶图。

C: N2-S & N2-A引物对鉴定纯合突变体胶图。