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秀丽隐杆线虫助力发现新的蛋白质参与中心体的形成

2019-11-04 09:20

中心体(Centrosomes)是动物细胞或低等植物细胞中一种重要的细胞器,是主要微管蛋白形成中心,它在双极性纺锤体的形成、细胞极性和细胞器定位中起着重要作用。它总是位于细胞核附近的细胞质中,接近于细胞的中心,因此叫中心体,与细胞的有丝分裂有关。

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有丝分裂与中心体

我们在电子显微镜下可以看到,每个中心体含有两个中心粒,这两个中心粒相互垂直排列。中心粒可以将围绕在中心粒外周物质(pericentriolar material、PCM)组织起来形成一个复杂的网状结构,该网状结构是有丝分裂过程中微管蛋白成核所必须的,微管蛋白成核又是纺锤体形成所必须,而纺锤体的完整性决定了染色体分裂的正确性,最终影响细胞的命运。


已有研究表明,在秀丽隐杆线虫中细胞的有丝分裂间期,PCM先形成以SPD-5为支架蛋白的PCM核,核外面环绕SPD-2、PLK-1等蛋白。而在细胞进入有丝分裂后,PCM核会在PLK-1蛋白(有丝分裂蛋白激酶)的帮助下迅速膨大成熟从而促使微管蛋白的成核形成。目前PCM核的形成机制尚不清楚。德国慕尼黑大学的Tamara Mikeladze-Dvali教授团队对PCM核的形成展开深入研究,成果发表在著名学术杂志Cell旗下子刊Current Biology。

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PCMD-1蛋白的发现

作者在研究温度敏感型突变线虫株t3421 时发现,在25度培养条件下,胚胎100%出现致死情况,而15度培养条件下有38%存活下来。研究结果显示胚胎致死的产生是因为该突变体使细胞第一次经历有丝分裂时不能形成双极性的纺锤体,细胞质不发生分裂,导致胚胎不能进行正常发育。这个时候作者还不知道该突变株突变的基因是哪一个。于是作者采用SNPmapping分析(单核苷酸多态性图谱)与全基因组测序,确定该基因为c17d12.7,已有的文献报道只说明该基因编码的蛋白 C17D12.7对纺锤体的组装是必须的,具体如何发挥作用与其他功能都没有描述。作者之后的研究发现该蛋白对PCM的组装和完整性有重要的作用,把该蛋白定义为 pericentriolar matrix deficient-1 (PCMD-1)。


因此,t3421,是在pcmd-1的编码区发生了一个无义突变,造成该基因提前被终止密码子终止,使得PCMD-1蛋白功能的缺失从而产生胚胎致死的表型。为进一步研究pcmd-1的功能,作者对pcmd-1进行了RNA干扰实验,发现在25度培养39h后胚胎存活率仅达到17%,同时作者又在上源生科构建的突变体pcmd-1(syb975)(从编码区的第一个外显子开始敲除1201bp)在25℃下培养,也出现了100%胚胎致死的情况,而15℃培养下有部分胚胎存活。因此,t3421 与 syb975一样是pcmd-1功能丧失的突变体, 同时再次证明pcmd-1对于纺锤体的形成的重要性。

PCMD-1在纺锤体的形成过程中是如何发挥作用的呢?

作者从确定PCMD-1所处的亚细胞结构位置开始研究,作者又在上源生科构建了一株基因编辑线虫株,在PCMD-1的N端(前面)插入了GFP荧光蛋白,运用抗GFP抗体和抗中心体SPD-5抗体的免疫染色方法,证实了PCMD-1是中心体的组成部分。作者同样用免疫染色方法证实了PCMD-1主要定位在中心粒上。


后续进一步的研究发现在有丝分裂间期,是PCMD-1蛋白将SPD-5、SPD-2、PLK-1招募至中心体PCM中形成PCM核,而且PCMD-1蛋白功能的缺失会影响PCM的组装和完整性。而在细胞启动有丝分裂后,PCM会在SPD-2、PLK-1蛋白的帮助下迅速膨大而促使微管蛋白的成核形成。这一进程也是依赖于PCMD-1蛋白的,具体机制如下图所示:

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(I-J)PCMD-1在中心体的定位与作用(中心粒外部红色代表PCMD-1,青色代表SPD-5,淡紫色代表SPD-2,紫色代表PLK-1)


I:在野生型线虫的胚胎中,PCMD-1位于PCM核的中心,并与SPD-5、SPD-2、形成紧密的PCM,细胞进入有丝分裂后,在PLK-1激酶的作用下PCM膨大成熟,促进后续微管蛋白的成核。


J:在PCMD-1功能缺失线虫的胚胎中,没有PCMD-1蛋白的参与,SPD-5、SPD-2不能定位到PCM核中,细胞进入有丝分裂后,SPD-5会招募少许的PLK-1,形成组织错乱的复合体,无法促使后续微管蛋白的成核。


综上研究,作者得出的结论如下:

1、在秀丽隐杆线虫中,PCMD-1是一个新发现的中心体蛋白质;

2、在有丝分裂间期,PCMD-1招募PCM核到中心粒上;

3、有丝分裂过程中PCM的组装和完整性依赖于PCMD-1的功能;

4、有丝分裂过程中,PCMD-1、 SPD-2、PLK-1招募SPD-5形成有功能的中心体