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线虫寿命的自动化测量综述

2021-11-22 11:17

                    摘要:秀丽线虫是一种非常有用的模式生物,通过秀丽线虫科学家已经成功地揭示了与衰老相关的基因及衰老的途径。长期以来,收集线虫的寿命的标准一直都是通过评估线虫在平板中的运动来进行人工判定。但传统的人工测量线虫的寿命既繁琐又费时,这大大限制了科研人员研究衰老机制的效率。为此,研究人员迫切需要一个自动化系统来测量线虫的寿命以及其他表型,如运动、线虫的体型和繁殖力。本文简述了目前已有的自动化或半自动化的线虫寿命评估方法。特别着重介绍了两种比较常用的线虫寿命自动化评估系统:微流控制设备法和平面扫描法,对两种方法的具体操作方法、流程、注意事项及利弊作了详尽的介绍。此外,还介绍了一些其它较为特殊的方法。


     衰老一直以来都是一个引起人们极大兴趣,却又十分困难的生物学问题。我们为什么会衰老?为什么有共同祖先的现代近亲物种有如此巨大的寿命差距?随着人口老龄化越来越严重,我们对衰老本质的探究将会变得越来越有意义。


     尽管目前在衰老的研究方面我们已经取得了一些进展,但关于衰老潜在的基本原因,仍有很多方面时至今日仍没有被完全解释清楚。实际上,衰老是与年龄有关的疾病(包括癌症、心脏病、阿尔兹海默症)的最大共同风险因素。因此,更深入地了解衰老的本质能够使我们在将来有能力开发出延缓相关疾病的发病年龄或减轻病症的治疗手段。


     秀丽线虫是一种非常有用的模式生物,通过秀丽线虫科学家已经成功地揭示了与衰老相关的基因及衰老的途径。且大多数的途径在哺乳动物也是保守的。目前已经有线虫的长寿命突变体,它的寿命最长能达到野生型线虫寿命的十倍。许多药物也被证明能够提高线虫的寿命,其中的部分药物在小鼠以及其他远亲生物中也能提高它们的寿命。长期以来,收集线虫的寿命的标准一直都是通过评估线虫在平板中的运动来进行人工判定。在人工寿命评估工程中,当线虫衰老以后,线虫的活力下降,运动减少,反应变得迟顿,人们通常需要用挑虫器去戳线虫,以判定线虫的存活与否。同时还需要将线虫间隔性地转板,以避免霉菌或细菌的污染。此外,人工寿命的评估还需要解决线虫亲代与子代分离的问题,以避免子代与亲代混淆,所以研究人员通常需要在48小时以内转板或添加FUdR以阻止线虫的生殖,另外还有一种方法就是使用温度敏感导致不育的线虫株。虽然这些方法看起来不会影响线虫的寿命,但事实上,FUdR会改变许多突变体线虫的寿命,转板过程中损伤线虫也会影响到线虫的寿命。


     传统的人工测量线虫的寿命既繁琐又费时,这大大限制了科研人员研究衰老机制的效率。正因为如此,研究人员迫切需要一个自动化系统来测量蠕虫的寿命以及其他表型,如运动、线虫的体型和繁殖力。最重要的是,测量量的巨大提升往往会激发出全新的实验类型,这在以前是无法想象的,这也是我们常说的量变引起质变。


     近些年来,在自动化收集及分析线虫的寿命方面已经取得了长足的进步。本文简述了目前已经有的线虫自动化或半自动化的线虫寿命评估方法。科研人员通过这些自动化的方法,极大提高了线虫寿命测定的效率,使得以前看起来不切实际的实验(如大规模的药物筛选)变成了可能。这些方法已经被证明是非常有用的,其中一些方法可能是将来更先进的自动化寿命评估平台的先驱,具有非常重大的潜力。自动化线虫寿命评估方法的出现,会加速我们对衰老机制的研究,完善我们对衰老的理解,并使得将来人们能开发出更好的治疗人们衰老相关疾病的方法。


     线虫寿命的自动化评估系统主要有两类,一是微流控制设备法,二是平面扫描法,其分别对应线虫液体和固体培养中寿命的测量。另外还有一些特殊的方法。接下来将会简要讲述这些方法,并分析这几种方法的优缺点。


     一、微流控制设备法

     得益于软光刻技术和光刻技术的发展,实验室规模的微流控制设备的生产得以研发成功。微流控控制设备通常包括入口(用于添加新鲜液体介质和食物),出口(用于清除废物、卵和后代),以及一个或多个用于线虫培养和检查线虫的区域。(如图1所示)微流控设备及其制造方法正在快速而持续地发展,其用途不仅仅局限于线虫的寿命测量。

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    1.1 WormFarm—用于自动测量寿命、平均寿命、体型和运动能力

     WormFarm是一种性能特别出色,适用于寿命评估的微流控制设备。WormFarm由三个模块组成。第一个模块是食物和介质装载模块,允许在线虫整个生命周期中以连续的方式引入细菌食物。第二个模块是WormFarm主体,在整个实验期间,线虫都被放置在这里培养。最后,第三个模块是图像采集模块,可以采集视频和静态图像,用于各种进一步的分析,包括自动化的寿命评估。由于这种方法可以通过控制食物的流入,所以可以实施食物限制和其它会影响寿命的喂养方式。另外WormFarm可以把子代幼虫或者卵给排出,所以也不需要添加FUdR(如图2所示)。

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    1.2 WorMotel—追踪线虫的行为和寿命

     WorMotel是一种微加工设备,旨在提供一种以高通量方式对老化线虫进行纵向监测的方法。在该系统的设计中,需要一种设备,来拍摄每只线虫的情况,同时需要充足的食物来源及标准化的设备尺寸,最后用高通量的方式进行数据收集。

    在96孔板中,线虫会爬上它们所在的孔的侧面。这使得它们很难被显微镜或其他成像设备观察到。此外,由于侧面没有培养基,长时间的脱水会导致线虫的死亡。为了解决这个问题,研究人员设计制造了一种带有小凹面孔板(见图3A),每口孔只容纳一只线虫,这个凹面还提供了非常好的观察视角。此外,孔的周围有一圈硫酸铜溶液,能防止线虫逃离。根据美国国家标准协会(ANSI)的标准尺寸,每个板可以容纳240只线虫。另外提供了可以使用现有的96或384孔板的方案。在这套系统中,每孔都含有线虫生长培养基(NGM)和细菌食物(如OP50)(见图3B)。这套系统不仅可以用来测量线虫衰老过程中的变化的,它同时也可以记录线虫的存活情况。使用聚乙二醇作为底层,上面滴加了线虫培养液,每个孔放置一条线虫,用聚二甲基硅氧烷(PDMS)进行封盖。(见图3C)

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   1.3Lifespan-on-a-chip—测量寿线虫的寿命、行为和生理表型

    Lifespan-on-a-chip是一种基于聚二甲基硅氧烷(PDMS)的微流控制设备,专为寿命评估而设计。同WormFarm类似,Lifespan-on-a-chip也配备了一个空间用来培养线虫,另外配备一个可以接收新鲜溶液和食物的入口,以及一个可以排出后代和代谢废物的出口(见图4)。此外,Lifespan-on-a-chip还创造性地使用楔形通道,以此固定单只需要测量的线虫。

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    二、基于平面扫描的方法

     平面扫描法的流程如图5所示。平面扫描法不仅能测量寿命,还能分析表型数据,它的另一个优势就是能比微流控制设备监测更多的线虫寿命。迄今为止最大量的单次寿命实验数据就是由平面扫描法创造的。下面就以Automated WormScan为例,进行简要的介绍。

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      Automated WormScan是目前最新的平板扫描法,是由WormScan改进升级而来。该方法以爱普生V800扫描仪为基础,改造而成,能够以完全的自动化的方式记录并分析线虫的寿命。分析的原理是通过分析扫描采集的图像,测量线虫移动的数量,从而得到存活线虫的数量。研究人员对比用Automated WormScan进行寿命检测与采用人工寿命检测发现,两种方式没有显著性的差异,说明该平板扫描法确实可以代替人工,进行寿命分析实验。


    三、其他途径

    LFASS

    该方法利用了线虫的“死亡荧光”来检测死亡的线虫。线虫即将死亡时,肠道内的邻氨基苯甲酸会发生糖基化,从而发出蓝色的荧光,这被称为死亡荧光,这是线虫濒临死亡的重要标志。目前这种方法主要应用于线虫在应激条件下的生存情况,例如:热休克、粪肠杆菌感染和氧化应激等。但是原理上这种方式应该也能用于正常的寿命检测。


    四、其他线虫追踪的方式

     我们将介绍一些线虫的自动化追踪的方法。这些方法目前不是用于收集生存或寿命数据,但可以作为未来线虫寿命自动化检测的方向。

    4.1 Worm Tracker 

     Worm Tracker是线虫行为自动化分析系统。最初用于测量线虫的平均运动速度和药物引起的瘫痪,但它在测量生物体运动和寿命方面有广泛的应用。这个软件还有其他用途,例如可以追踪线虫的生命周期,将来还可能衍生出更多的功能。

    4.2  QuantWorm

     QuantWorm是一个软件包,它能分析图像和视频从而获得线虫的寿命和运动。该软件包包含WormScanner数据采集模块,以及四个分析模块,分别为WormLocomotion、wormEgg、WormLength和WormLifespan。

    4.3  Wide Field-of-View Nematode Tracking Platform (WF-NTP)

     WF-NTP使用基于Python的程序来分析摄像头收集的数据。该软件通过量化线虫每分钟的身体弯曲次数,可以精确地测量线虫的瘫痪情况。由于是开源软件,所以WF-NTP还允许用户自己修改程序,以针对特定的环境进行调整。虽然目前开发者没有对这套系统的寿命检测能力进行分析,但是开发者还是认为这套系统可以用作寿命的自动化分析,并鼓励用户去尝试。

    4.4  wormlab

     wormlab是Mbf公司开发的用于对秀丽线虫和其他线虫进行成像、跟踪和分析的软件。带有一个强大的特定模型跟踪算法,可以收集关于单条或多条线虫的相关数据,包括线虫的运动轨迹、运动速率、体长体宽等信息数据。


     总结

     这些线虫的自动化检测方法以及将来在此基础上发展出来的技术方法,对我们探索秀丽线虫的衰老机制,发挥极其重要的作用,也将有助于我们更广泛地理解衰老在生物间的保守机制。


     上源生科目前可以提供包括线虫寿命检测、繁殖力分析、体长和发育分析、摄食能力、运动能力、抗氧化性、热敏感性、抗感染能力在内的多种线虫表型及特征分析服务,并可以运用Wormlab、Worm Tracker软件进行线虫相关表型的自动分析,相较于传统的人工检测,不仅能克服人的主观因素带来的误差,还极大地提升了检测的效率。


     上源生科现已为国内外高校及科研机构完成近百个上述科研服务订单,我们诚邀有需求的各高校、科研机构的老师们咨询、洽谈,也希望老师们与我们共商合作实施相关科研项目。


参考文献

Daniel P. Felker and Christine E. Robbins and Mark A. McCormick. Automation of C. elegans lifespan measurement[J]. Translational Medicine of Aging, 2020, 4 : 1-10.