Cell｜睡眠不充足，记忆不长久

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研究人员进行了巧妙的实验设计，首先是安排线虫进行忽略丁酮气味的记忆训练。线虫在有丁酮无食物的管子，以及有食物无丁酮的管子间反复训练三次（如图2所示），使线虫形成了丁酮气味等于没有食物的记忆（未经训练的线虫特别喜欢丁酮的气味，会被丁酮气味所吸引）。在0小时以及16小时测定训练后的线虫对丁酮的化学趋化性，发现训练后线虫对丁酮趋性显著降低，这说明线虫训练形成的记忆可以保持达16小时。同时在记忆训练后，线虫的睡眠增加，即线虫表现出较长的唤醒时间，较为静止的运动状态，咽泵跳动频率降低等。ALA是线虫中已知的睡眠促进神经元，ALA缺陷的ceh-17(np1)突变体线虫在训练16小时后的丁酮气味记忆消失了；此外，ALA下游基因缺失的acy-1(ce2)突变体线虫在丁酮气味记忆训练后，不会增加睡眠时间，且无法产生气味记忆。相比之下，RIS缺陷的aptf-1突变体线虫的气味记忆能力与野生型无差异。这些结果表明训练诱导了线虫持久的记忆和静息，表现出睡眠的特征，且需要ALA神经元的参与。

图2：线虫丁酮气味记忆训练

CREB是长期记忆中已知的关键蛋白，研究人员探究了该蛋白在线虫的丁酮气味记忆中发挥的作用。CREB缺陷的crh-1(tz2)/CREB突变体线虫的初始学习能力与野生型无差异，但该线虫无法在16小时后仍保持气味记忆（图3A-B）。此外，研究人员还分析了睡眠和记忆的相关性，线虫训练后1小时内的记忆能力与睡眠时间无关（图3C），但训练后16小时的记忆与训练后1小时内的睡眠时间呈正相关，即训练后睡眠时间越长，记忆巩固的越好（图3D）。

图3：长期的嗅觉记忆需要CREB，并与训练后的睡眠相关

睡眠对长期记忆是必要的。研究人员对训练后不同时间的线虫进行机械力干扰睡眠。在训练后2小时内干扰线虫的睡眠，线虫的记忆会被严重破坏，而2小时以后再干扰线虫的睡眠，则无法破坏线虫的记忆（如图4所示）。这表明训练后两小时内的睡眠对线虫形成长期记忆非常重要。

图4：训练后干扰线虫会阻碍记忆

随后研究人员进行了一项实验，旨在探究增加睡眠时间是否能够将微弱的短期记忆转化为长期记忆。为此，他们设置了不同睡眠时间的线虫组，并进行了相关测定（如图5所示）。实验结果表明，睡眠时间更长的线虫组在经过相同时间的训练后，其长期记忆的表现比睡眠时间较短的组更好。随着睡眠时间的增加，记忆衰退的程度越小。值得一提的是，该实验通过线虫游泳来改变线虫的睡眠时间，具有很高的实验设计巧妙性。

图5：通过增加液体食物中的游泳循环来改变线虫的睡眠时间

AWC是丁酮感受神经元，通过瞬时钙离子成像技术，研究人员发现AWC感觉神经元反应的变化不太可能是促进线虫对丁酮长期记忆的原因。此前有电镜研究结果表明，AWCs与三对中间神经元AIYs、AIBs和AIAs形成突触。因此他们推测，负责长期记忆的细胞可能位于化学感觉回路中AWCs的下游。比对了几株相关缺陷的突变体线虫后，研究人员发现下游神经元AIY的缺陷会破坏线虫对丁酮的长期记忆。接下来的重点就是研究睡眠是否影响AWC和AIY神经元之间的连接。为了实现AWC-AIY突触的可视化，研究人员构建了AWC-AIY突触荧光报告系统 NLG-1 GRASP。该系统使用两个互补的GFP片段（GFP1-10和GFP-11）与NGL1相连，NGL-1定位于突触前后，当突触形成时两个GFP片段重组并表达（如图6A）。结果表明，在接受丁酮训练的线虫中AWC-AIY突触连接显著减少（如图6D/E）。在丁酮记忆训练后0-2小时内干扰线虫的睡眠，AWC-AIY突触连接会不断减少。这表明丁酮气味记忆训练后，AWC-AIY突触减少需要睡眠。

另外还需说明的是，研究人员运用PHB-AVA NLG-1 GRASP技术发现，丁酮气味记忆训练不会对PHB-AVA突触产生影响。这表明丁酮气味记忆训练产生的突触变化不是广泛性的。最后，研究人员还验证了训练后不同时间段内突触变化的速率。他们发现，在训练后的两个小时内，突触变化速率较快且不依赖于气味，随后在接下来的14个小时内，突触变化速率较慢，且这种突触的减少依赖于气味。

图6：气味训练和睡眠导致AWC-AIY突触减少

我们通常认为长期记忆的形成与突触的形成有关，然而该研究结果打破了这一常规认知，这将是一个巨大的突破。此外，该研究还巧妙地运用了GRASP系统来观察突触的形成，这对于基因编辑线虫的研究也具有很大的借鉴意义。

该研究在实验设计上十分精巧有趣，强烈建议大家阅读原文。