从点到面带您了解血清素能系统的功能组织

众所周知，血清素 （5-HT） 是人类中枢神经系统和周围神经系统中的主要神经递质之一。血清素（5-HT）信号通路参与了行为、认知、情绪、食欲调节等诸多方面，血清素能系统的功能障碍与精神疾病有着密不可分的联系，它也是精神药物最常见的作用靶点。人类大脑中释放血清素的神经元在功能上是多样化的，并通过14种不同的血清素受体发挥作用。然而，血清素的动态释放是如何通过特定的血清素受体来改变神经动力学和行为的呢？对其机制的研究无疑是一个巨大的挑战。不过，在仅有302个神经元的秀丽隐杆线虫身上，对这一问题的探究变得相对容易。

对于上述的问题，近日麻省理工学院的Steve Flavell团队在《Cell》上发表的“Dissecting the functional organization of the C. elegans serotonergic system at whole-brain scale”文章给我们带来了全新的见解。

秀丽隐杆线虫的5-羟色胺能系统的组织结构类似于哺乳动物，它利用相同的合成（tph-1/TPH、bas-1/ AAAD）、囊泡负荷（cat-1/VMAT）和再摄取（mod-5/ SERT）机制。线虫有三对5-羟色胺能神经元（NSM、HSN和ADF），估计超过100个神经元能表达5-羟色胺受体。虽然产卵是由身体中部的5-羟色胺能神经元HSN控制的，但其他食物诱导的行为变化是由头部的5-羟色胺能神经元NSM控制的。NSM神经元将感觉树突延伸到咽部，并直接感知食物，并且NSM只在进食时才活跃，它的活动与缓慢的运动密切相关。目前，已经鉴定了6种线虫血清素受体，其中四种（MOD1、SER1、SER4、SER5）被认为与运动相关，而SER7则是对进食产生影响。那么，血清素受体是如何与运动产生联系的呢？

首先，研究人员利用光遗传学原理，通过光激活NSM::Chrimson神经元来模拟线虫遇到食物时的运动变化：运动速度和头部运动的下降，以及进食（即咽部泵送）的增加，其结果类似于当动物遇到食物时的变化

当NSM::Chrimson线虫分别与6种缺乏单一血清素受体的突变体杂交后的实验发现：与野生型相比，每个突变体的行为反应都减弱了（见图1）。当NSM::Chrimson线虫与仅剩一个血清素受体的五倍突变株杂交后发现：只有在mod-1、ser-4或lgc-50完整的突变体显示出NSM诱导的不同程度的运动速度减慢（见图2）。为了解释这些受体是如何相互作用的，研究人员将NSM::Chrimson与64个带不同突变背景的线虫进行了杂交，这些突变背景缺乏所有可能的血清素受体组合，并量化了它们在NSM诱导下的运动速度减缓，通过分析表明mod-1、ser-4或lgc-50是驱动减速的主要受体，称之为“驱动”受体。

图1  单一血清素受体缺失突变株（单突变株）在光激活NSM::Chrimson神经元后的运动速度变化

图2   5种血清素受体缺失突变株（五突变株）在光激活NSM::Chrimson神经元后的运动速度变化

不过，不同的血清素受体的激活会驱动不同的行为动态变化。对于驱动缓慢运动的三个受体，在持续的NSM刺激期间，缓慢运动的维持时间是不同的。只要NSM活跃，mod-1-only突变体呈现出长时间的减速，而ser-4-only突变体仅在刺激开始时表现出运动速度的短暂下降（见图3）。mod-1是一种5-羟色胺门控氯离子通道，而ser-4是一种G蛋白偶联受体，但两者都以一种抑制性的方式发挥作用。那么，这种差异性行为表现的原因又是什么呢？是血清素释放动力学的差异（对NSM的反馈），受体的分子特性，还是这些抑制性受体表达的神经元的特性？

通过比较mod-1/ser-7-only和ser-4/ser-7-only的突变体，可以发现它们运动衰减率的差异仍然很明显（见图4）。然而，NSM刺激的进食行为是相同的，这表明这两株线虫之间的血清素释放量不太可能有所不同。

接下来，通过交换mod-1和ser-4的表达位点，检测NSM诱导的行为变化。在缺乏所有六种已知线虫血清素受体的六突变体线虫中表达Pser4::mod1，当血清素释放时表现出短暂的运动减慢，其结果与ser-4-only突变株和表达Pser4::ser4六突变体线虫是一致的。相反的，在mod-1启动子下表达ser-4的线虫（Pmor-1::ser-4）在整个光遗传刺激中表现出运动速度持续减慢，与mod-1-only和Pmod-1::mod-1线虫的结论是统一的。由此可见，受体的表达位点，而非它们的分子特性，在赋予它们所支持的行为动力学中发挥了主导作用。

图3   不同强度的光激活NSM::Chrimson期间不同突变体的速度变化

图4   4种受体缺失（四突变体）的线虫的运动衰减率差异和相同的进食速度

首先利用CRISPR-Cas9技术，将T2A-mNeonGreen报告基因插入到6个血清素受体基因的终止密码子前，并将这6个线虫株分别与NeuroPAL转基因线虫杂交，通过报告基因对表达受体的神经元细胞进行定位。结果表明：每个受体在118个线虫神经元分类中的9-24个中表达。总共有52种神经元表达了至少一种受体。每个血清素受体都以一种独特的模式表达。一些单独的神经元种类表达多达五种不同的血清素受体（见图5）。并且这些受体在中间神经元中显著富集，在运动神经元中表达量极低，在感觉神经元中部分富集（见图6）。

图5  6个荧光报告基因线虫株及受体表达的神经元细胞定位

图6  感觉神经元、中间神经元和运动神经元中血清素受体的表达量。

红线表示所观察到的实际受体数量

为了确定哪些受体表达位点对运动具有重要的功能。研究人员选择对mod-1进行检测，因为mod-1的唯一表达就可以导致快速和持续的运动变化。其中，上源生科构建的mod-1(syb5397)线虫是将mod-1的部分外显子倒置，利用Cre/LoxP技术，在全部或特异性神经元细胞中表达Cre，观察基因功能挽救的情况。结果显示：在RID，ALA这两个神经元中表达Cre，mod-1基因拯救导致线虫在NSM激活时表现出短暂的运动减缓，类似于ser-4-only的线虫表型。而在RIF神经元中表达Cre，rescue线虫呈现出持续性的运动减缓。这表明，NSM激活期间的初始减缓和NSM激活期间的持续减缓是可分离的效应，是由不同神经元中的mod-1功能介导的。

图7   F:利用CRISPR-Cas9技术构建的mod-1(syb5397)线虫

G-I:不同种类神经元细胞表达Cre对运动行为变化的影响

随后，研究人员利用钙成像技术来探索NSM的活动是如何与整个大脑的神经活动的变化产生关联的。实验表明：分别有33%和21%的神经元与NSM或其衍生物呈显著相关。总体而言，在NSM活跃时，总共45%的神经元活性发生了变化。控制运动和头部弯曲网络的神经元的活动与NSM活动呈负相关，而与进食网络的活动呈正相关。并且仅表达兴奋性血清素受体的神经元更可能与NSM呈正相关，而具有抑制性和兴奋性受体的神经元更可能与NSM呈负相关（见图8）。当然，NSM的功能相关性仍然不能完全通过每个神经元的血清素受体表达谱来预测。研究人员发现，在一个神经元及其突触前伙伴中，血清素受体的表达模式部分预测了哪些神经元与NSM相关。这表明血清素受体表达模式和突触相互作用共同作用，形成血清素相关的大脑动力学。

图8   NSM与其他神经元间的相关性

总的来说，这项研究提供了一个关于血清素如何作用于分布在连接组上的多种受体来调节全脑活动和行为的全局视图。同时这些发现也揭示了药物开发人员面临的各种复杂的情况，而线虫模型的构建及成像技术的进步可以帮助研发人员大幅度缩短药物开发时间。