ROS水平和衰老之间的倒U型剂量曲线关系

作者测试了NAC、维生素C、RSV在不同浓度梯度下对野生型线虫寿命的影响，并发现NAC和RSV的延长寿命效果与浓度正相关。维生素C对线虫寿命没有影响。由于百草枯的延寿效果已经有研究表明呈倒U型曲线，且最佳延寿浓度为0.1mM，因此作者只验证了0.1mM浓度下的延寿情况（图1A-D）。

线虫bus-8基因突变使其表皮通透性增加，从而增强对外源化合物的表皮渗透摄取能力（现已有更好的突变株bus-5(br19)）。作者使用上述促氧化剂和抗氧化剂处理线虫，得到与野生型线虫不同的效果。在50 μM RSV处理下，未能观察到bus-8(e2698)突变株寿命的延长，而250 μM RSV处理下的线虫寿命与野生型没有明显差异（图1 E）。更引人关注的是，NAC处理在3mM和6mM的较低浓度下效果最佳，但在9mM剂量处理下bus-8(e2698)突变株的寿命缩短（图1 F）。维生素C处理结果与野生型之间的差异最大，5mM和10mM浓度下都能显著延长线虫寿命（图1G）。

图1. NAC、维生素C和RSV对野生型和bus-8突变株线虫寿命的影响

CLK-1功能的丧失导致线粒体功能减弱、线粒体氧化应激增加和寿命延长。NAC处理对clk-1(qm30)突变株（图2A）的作用效果类似于bus-8(e2698)突变株，低浓度下能显著延长线虫寿命，但在最高浓度下（9 mM）却严重缩短了线虫寿命，且缩短的程度似乎受两种突变叠加影响。推测是由于bus-8(e2698)突变株增加了线虫体内NAC的浓度，导致clk-1(qm30)突变株在高浓度时寿命缩短更为显著。

isp-1(qm150)点突变减缓线粒体电子传递并增加线粒体超氧化物生成，但不增加一般氧化应激或对超氧化物解毒损失的敏感性。NAC处理对isp-1(qm150)点突变株线虫在低浓度条件下有很好的延寿效果，随着浓度的升高，延寿效果降低，呈典型的倒U型剂量反应关系。而在过去的研究中，水溶解的NAC处理对isp-1(qm150)点突变株却是造成了减寿的效果。因此，DMSO的存在似乎使得NAC能够达到此前未曾表现出来的延长寿命效果。

维生素C在clk-1(qm30)突变株上表现出显著延长寿命的效果，这与其在野生型线虫上的表现有着明显的不同。但在clk-1(qm30)；bus-8(e2698)双突变株中，维生素C不仅在5 mM浓度下不能延长双突变株的寿命，在10 mM浓度下甚至会缩短线虫寿命。这表明，当维生素C的浓度和渗透率较高时，其会缩短寿命，这是延长寿命和缩短寿命效果之间的平衡结果。RSV在clk-1(qm30)和isp-1(qm150)突变株上的作用也与在野生型线虫上的作用明显不同，均表现出缩短clk-1(qm30)和isp-1(qm150)突变株线虫寿命的效果（图3A、3C）。在clk-1(qm30)；bus-8(e2698)双突变株中，寿命缩短更为显著（图3B）。为了进一步探索RSV的特性，作者还测试了另外两个呼吸链复合物亚基缺陷导致寿命改变的突变株（nuo-6(qm200)、gas-1(fc21)）。在两个浓度条件下，RSV都缩短了突变株线虫的寿命，且在较低浓度下缩短的更为显著（图3D、3E）。因此，RSV的剂量反应关系呈U型曲线，而不是像NAC和维生素C一样呈倒U型。

图2. NAC和维生素C对各突变株寿命的影响

图3. RSV对各突变株寿命的影响

根据作者的研究结果，PQ能够延长gas-1(fc21)突变株线虫的寿命（见图4A），与PQ延长野生型线虫寿命的结果一致。因此，作者推测在gas-1(fc21)突变株中，PQ诱导的ROS增加至少对某些类型细胞是有益的。作者猜测，gas-1(fc21)突变株中的特殊缺陷可能不会增加大部分相关类型细胞中的线粒体ROS（mtROS），但可以通过PQ诱导产生。

对于完全缺乏超氧化物歧化酶活性的突变体（sod-12345），研究表明其与野生型线虫的寿命没有差异，可能是由于其ROS水平的有害效应和促寿命效应之间的平衡导致的。实验结果表明，无论PQ的浓度如何，都会导致该突变株的寿命降低。然而，维生素C在野生型线虫上没有效果，却能显著延长该突变株的寿命（见图4B）。此外，NAC也能显著增加该突变株的寿命（见图4C）。

图4. NAC、维生素C、RSV和PQ对各突变株寿命的影响

上述研究已经表明，NAC、维生素C和RSV这三种抗氧化剂的寿命活性受到线粒体功能、活性氧生成和角质层渗透性的影响。然而，每种抗氧化剂在不同突变株上的效果也并不相同。同时，研究也表明不同的化合物可能作用于不同的细胞类型、细胞区室或位点。为了进一步探索这一点，作者测试了RSV和NAC对野生型线虫的影响是否具有叠加效应。研究发现，在所有浓度下，NAC的效果与RSV的效果叠加，延长了线虫的寿命。特别是在NAC浓度最高的情况下，RSV的叠加效应更为明显。

作者还使用了固定浓度的RSV和不同浓度的PQ处理野生型线虫（图5B）。结果观察到RSV和PQ似乎是独立起作用的，RSV在所有浓度的PQ中具有相同的效应。这可能是因为PQ和RSV作用于不同的细胞类型或同一细胞内的不同位点，导致它们具有独立的作用方式。

图5. RSV和NAC；RSV和PQ的叠加效应

目前，我们还无法针对线虫进行特异性细胞或亚细胞水平的ROS或氧化损伤检测。主流的方法主要是通过DCF荧光评估测试来评估抗氧化化合物是否能够降低线虫整体的ROS水平。在这项研究中，作者使用了三种抗氧化剂（NAC、维生素C和RSV）处理野生型线虫，结果显示，无论何种浓度的抗氧化剂都能降低DCF荧光信号的强度。然而与我们的预期不同的是，降低ROS水平的幅度并不一定与寿命的延长程度成正比。

综上所述，DCF荧光测试可以反映出抗氧化剂对整体ROS水平的抗氧化能力，但并不与寿命呈线性相关关系。这说明在线虫寿命调控中，除了ROS水平外，可能还存在其他的调控机制。

图6. 不同处理对ROS水平的影响

作者的研究发现，突变或促氧化剂处理导致ROS生成增加对寿命有益，通过观察促氧化剂PQ的剂量和寿命之间的关系，发现存在一个倒U型的剂量曲线。这种关系可能是ROS水平适度增加的有益作用和剂量依赖性共同作用的结果，高水平和低水平的ROS都对寿命不利。然而，当一个生物体接受化合物处理时，很难确定哪些组织和/或细胞类型受到处理的影响，哪些不受影响。我们很难确定特定细胞中是否获得了足够浓度的化合物，或者给定细胞是否实际上对该化合物敏感。同样，很难确定该化合物在细胞的哪个亚细胞区域起作用。

作者提出了一个针对促氧化剂和抗氧化剂的多目标模型（图7）。任何化合物对生物体寿命的影响将取决于该化合物对所有细胞类型和区域的综合效应。因此，它不仅取决于化合物的氧化还原性质，还取决于该化合物能够到达和影响的细胞类型（这取决于所用的溶剂、渗透入生物体的难易程度等）。目前尚不清楚是否有任何单一细胞类型本身在ROS水平和整个生物体寿命之间表现出倒U型的剂量反应关系。化合物的作用可能是由于对多个亚细胞作用位点的共同作用。

图7. ROS与寿命关系模型图