实验解析丨线虫麻醉剂的效果评估

叠氮化钠（NaN3）是一种无色无味的化学物质，在科学研究中被广泛应用，既可以作为防腐剂，也可以作为麻醉剂。叠氮化钠具有高毒性，其作用机制是通过抑制细胞色素氧化酶快速消耗细胞内ATP。叠氮化钠处理可诱导线虫缺氧，最终导致死亡；也可以用来快速固定线虫，使其成为行为测试或成像相关研究的理想工具。由于其毒性，叠氮化钠在中国等一些国家受到严格监管，根据我国政府2015年发布的《危险化学品分类信息表》，叠氮化钠、叠氮化钡和叠氮化铅均属于受监管的危险化学品。

除叠氮化钠外，左旋咪唑和1-苯氧基-2-丙醇（1P2P）也被用于线虫固定。然而，根据已发表的文献，趋化性试验主要采用叠氮化钠进行麻醉固定，左旋咪唑和1P2P并未得到应用。为了检测左旋咪唑和1P2P在趋化性试验中是否有效，研究人员比较了它们与叠氮化钠和叠氮化钾（KN3）在趋化性试验中的性能。实验采用异戊醇（IAA）进行1小时的趋化，当叠氮化钠或KN3用于趋化性试验时，所有线虫在试验结束时均被固定，而左旋咪唑和1P2P都无法有效麻痹线虫（图1）。不过，当线虫浸泡在含有左旋咪唑或1P2P的液体中时，可以有效引发线虫瘫痪。这些结果表明，叠氮化物在固定线虫方面可能具有更强、更剧烈的作用，这对趋化性试验具有重要意义。

图1  在趋化实验中几种麻醉剂的效果比较

根据在线数据库Chemtown（www.chemtown.cn）的搜索结果，KN3、三甲基硅基叠氮化物（TMSA）和二苯磷酰叠氮化物（DPPA）均未列入2015危化品名录，且价格合理。基于以上信息，研究人员将这四种叠氮化物进行比较。

  首先，从这四种化合物的气味性方面比较线虫是否对其有趋化性。实验结果显示叠氮化钠和DPPA对线虫有微弱的吸引力，趋化指数（CI）约为0.2（图2）。对此，小编认为在趋化实验中，需要在同一平板的实验一侧和对照一侧滴加等量的叠氮化钠。通过这样的操作，可以更好地比较线虫在不同化合物条件下的趋化行为，保证实验的准确性。

图2  四种化合物对线虫的吸引性比较

其次，在趋化实验中，将这四种化合物作为麻醉剂进行效果评估。采用IAA趋化试验或2-壬酮（2-NN）化学回避试验，并分别使用1 uL 1M叠氮化钠/KN3/TMSA/DPPA作为麻醉剂。根据观察，与使用叠氮化钠作为麻醉剂相比，使用KN3作为麻醉剂在IAA趋化试验或2-NN化学回避试验中均没有改变CI。然而，当使用TMSA或DPPA作为麻醉剂时，对IAA或2-NN趋化性的绝对CI值显著降低，说明TMSA或DPPA的麻痹作用弱于叠氮化钠或KN3（图3）。研究结果表明，在琼脂平板行为实验中，KN3、TMSA和DPPA均能麻痹秀丽隐杆线虫，而仅有KN3与叠氮化钠具有类似的效果。

图3  在固体平板中比较四种化合物的麻醉效果

随后，针对线虫麻醉后的恢复时间进行比较。当线虫被叠氮化钠麻醉后，它们可以逐渐从瘫痪中恢复过来。为了检测叠氮化钠或KN3所致瘫痪的线虫在琼脂平板上试验后是否能恢复，研究人员在趋化试验后收集了这些线虫，并将它们放在含OP50的NGM平板上，以观察它们的恢复情况。结果显示，这些线虫均可在18分钟内逐渐恢复，恢复时间过程相似。这些数据进一步证实，叠氮化钠和KN3的作用是麻痹线虫而非杀死它们。

图4  线虫麻醉后的恢复时间

最后，通过在液体环境中观察四种化合物对线虫的麻醉效果。在线虫相关的成像实验中，相对较低浓度的叠氮化钠缓冲液被广泛应用作为麻醉剂。为了测试KN3、TMSA及DPPA是否能有效地麻痹线虫，研究人员将线虫浸泡在含有25 mM不同叠氮化物的M9缓冲液中。记录线虫在M9缓冲液中有或没有麻醉剂时的行为，并比较了它们的瘫痪时间。结果表明，在25分钟的观察时间内，未接触麻醉剂的线虫在M9缓冲液中基本保持运动，而叠氮化钠、KN3、TMSA和DPPA的存在会使线虫在M9缓冲液中表现出一定程度的麻痹作用，其中TMSA的麻痹效果最为显著（图5）。

图5  在液体中比较四种化合物的麻醉效果（X轴上数字表示每一组的样本数量）

基于上述发现，KN3可以在趋化性实验和液体实验中产生与叠氮化钠相当的麻痹效应。考虑到叠氮化钠在中国受到严格的监管，KN3或许是一款非常适合国内实验室研究使用的麻醉剂。此外，虽然TMSA和DPPA确实对线虫具有一定的麻痹效果，但基于以下原因，小编并不建议它们作为秀丽隐杆线虫实验室的常规麻醉药。

首先，现有的数据表明，TMSA和DPPA在琼脂实验中的麻痹作用明显弱于叠氮化钠和KN3。

其次，DPPA在M9缓冲液中诱导线虫瘫痪的能力相对较弱，可能是因为它不溶于水。

第三，我们观察到TMSA和DPPA都释放刺激性气味，可以被人吸入，这表明它们在实验过程中可能发生蒸发。考虑到叠氮化物的潜在毒性作用，在正常的实验室条件下使用TMSA或DPPA而不采取额外的预防措施是不安全的。