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RNA荧光原位杂交（RNA Fluorescence in situ hybridization，RNA FISH）技术是一种精确的分子细胞遗传学方法，该技术使用特异性荧光探针，这些探针仅与核酸序列中的特定部分结合，并且要求高度的序列互补性。生物医学研究人员于20世纪80年代早期开发该技术用于检测和定位染色体上特定DNA序列的存在或缺失。通过荧光显微镜，研究人员能够观察到荧光探针与染色体结合的具体位置。在实际应用中，FISH常用于探寻DNA的特定特征，其在遗传咨询、医学和物种鉴定等方面具有广泛的应用价值。此外，FISH技术还可用于检测和定位细胞、循环肿瘤细胞和组织样本中的特异性RNA靶点（mRNA、lncRNA和miRNA）。在这种情况下，研究人员可以通过FISH技术更深入地理解细胞和组织中基因表达的时空模式。
秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）是研究宿主－微生物相互作用的优秀模型。传统的研究方法是通过喂食表达荧光蛋白的细菌以此来确定其在线虫体内的分布情况，但这种方法无法有效区分线虫肠道内细菌的生命状态，因此无法确定细菌在肠道内的定植情况。美国加州圣地亚哥州立大学的Kayla M Poirier等提出采用RNA荧光原位杂交的方式对线虫肠道内的细菌定植进行检测，与传统的荧光蛋白标记细菌相比，RNA荧光原位杂交可以区分完整细菌和死亡细菌之间的差异。因此，研究团队建议将RNA FISH作为检测线虫肠道中活细菌存在的首选方法。
在进行结果分析之前，我们首先需要了解一些基础知识。
1.OP50无法长期定植于年轻健康的线虫肠腔中。
2.LUAb3是一种能附着在线虫肠道内并定植的细菌，作者构建了转座子介导tdTomato插入的LUAb3菌株（插入tdTomato后该菌株被命名为LUAb18）。
根据实验结果，我们可以发现，当线虫被喂食OP50-GFP时，其肠腔中并未检测到红色荧光（CF610）的FISH信号（如图1C所示）。这与OP50无法长期定植于年轻健康的肠腔中的过往研究一致。尽管FISH-CF610可以在线虫的咽部中检测到OP50存在，但线虫咽球末端内的研磨器有效地粉碎了细菌，导致肠道下游未观察到FISH-CF610荧光信号，这一现象有助于我们有效鉴别活的OP50和被粉碎后死的OP50（图1A、1G）。而相比较之下，OP50-GFP既可以在咽部中观察到，也可以在肠道中观察到，这与OP50不能长期定植于年轻健康的肠腔中的事实相矛盾（图1B）。
为了进一步增强验证的可靠性，作者还选用了另外一种荧光基团——FISH-FAM，进行了同样的验证。在喂食OP50-tdTomato的线虫肠道内观察到了红色荧光（图1E），同样FISH-FAM的荧光信号只能在咽部被破碎前观察到，不会在肠道中观察到（图1D、1F）。
最后，作者用LUAb18喂养线虫，并用FISH-FAM进行原位杂交观察。实验结果显示，tdTomato的红色荧光和FISH-FAM的绿色荧光都能被观察到（图1H、1I）。综合荧光的定量分析（图1J、1K），可以明确得出结论：LUAb18确实是以活菌的形式定植在线虫的肠道中。
值得注意的是，GFP在线虫体内的半衰期长达24h以上，而tdTomato更是高达72h以上。因此在观察线虫荧光时，我们不能忽略这一关键时间点。关于RNA FISH的具体实验方法，请详细参阅原文。
图1 细菌荧光法和FISH法测定成年第二天的N2图像
参考文献：
Poirier KM, Luallen RJ, Rivera DE. RNA fluorescence in situ hybridization (FISH) as a method to visualize bacterial colonization in the C. elegans gut. MicroPubl Biol. 2024 Feb 27;2024:10.17912/micropub.biology.001044.
doi: 10.17912/micropub.biology.001044. PMID: 38481555; PMCID: PMC10935869.
撰稿：张壬辉
审核：陈岚彬
编辑：余雯
