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奥林匹克格言“更快、更高、更强——更团结”象征着人类不断追求卓越、永不满足的奋斗和拼搏精神。同样地，科学家在荧光蛋白研究领域，亦不懈地追求着“更亮、更稳定、单体”的突破。秀丽隐杆线虫作为荧光蛋白应用的先驱模式生物，为科研工作者提供了宝贵的实验素材。上源生科也曾系统总结了在线虫中使用过的部分荧光蛋白，以期为后来的研究者提供有益的参考。（传送门：上源教你如何应用荧光蛋白进行秀丽线虫研究）
最近，中国西湖大学和俄罗斯科学院等多所院校合作，成功开发出了一种新的绿色荧光蛋白单体——mBaojin（意为“保金”，取自英文StayGold的直译）[1]。mBaojin是由其前体蛋白StayGold（一种野生型Ceratocystis uchidae水母中的绿色荧光蛋白）改造获得的（图1，除了mBaojin外，最近还有两篇文章也对StayGold进行单体化改造，其分别为StayGold-E138D[2]和mStayGold及mStayGold2[3]）。但由于StayGold会形成二聚体，因此限制了其在蛋白荧光标签、膜定位标签以及生物传感器等方面的应用。因此，科研团队需要对StayGold进行改造使其呈现出更好的单体化，同时保留其前体的有益特征。
图1 Ceratocystis uchidae中的绿色荧光蛋白改造的过程
单体StayGold筛选过程
文章中为了促进在细菌中筛选单体StayGold，作者巧妙地运用了DNA结合结构域蛋白AraC（AraCDNA）与荧光蛋白融合（StayGold::AraCDNA）的策略。简单地说，由鼠李糖启动子控制表达的StayGold::AraCDNA中，StayGold若表现出二聚体性，那么StayGold::AraCDNA就会以二聚体形式结合在果胶糖启动子上，从而引起更多报告基因mTagBFP的转录翻译；但StayGold::AraCDNA中StayGold若表现出单体性，那么在果胶糖启动子就只有单体结合，导致报告基因mTagBFP产生的蓝色荧光信号显著减弱（图2）。
图2 筛选单体StayGold流程原理
在每轮随机突变筛选过程中，作者挑选蓝色荧光信号比较暗而绿色荧光信号最亮的菌落，并通过快速蛋白液相色谱（fast protein liquid chromatography，FPLC）技术确认它们的单体性。经过八轮定向进化后，成功确定了一种亮度最高的绿色荧光蛋白单体，同时在该单体上添加mNeonGreen蛋白的N端和C端作修饰，以确保其在哺乳动物细胞中稳定表达，并将其名为mBaoJin（图3）。mBaoJin在高浓度下有大约99%呈现出单体性，高于mNeonGreen（95%），而其前体StayGold并没有表现出单体性。此外，在与其他荧光蛋白的比较中，mBaoJin在吸收和荧光光谱特性、亮度、光稳定性、成熟时间和pH稳定性等多个关键参数上均有良好表现。
图3 mBaoJin与StayGold氨基酸序列比较
mBaoJin在线虫中的表现
福建上源生科协助该文章作者完成游离型线虫品系的编辑工作。得到的游离型线虫用于在绿色通道中评估荧光蛋白的细胞内定位、亮度和光稳定性。为确保荧光蛋白在线虫体内的高效表达，作者使用在线线虫密码子调试器，对编码DNA序列进行了优化，在其中插入两个合成的内含子。将由tag-168泛神经元启动子表达的绿色荧光蛋白质粒注射到野生型N2背景线虫中。实验结果显示，在线虫神经元中，mBaoJin荧光蛋白的细胞内亮度相较于mNeonGreen荧光蛋白显著提高了约两倍（图4a-c）。在持续的照明条件下，mBaoJin展现出了优异的光稳定性，其光漂白率较于mNeonGreen 降低了四倍，即便经过长达15分钟的持续照射，仍保留超过50%的初始荧光值（图4d）。这些结果充分证明了mBaoJin荧光蛋白在线虫神经元中不仅具有高亮度的特点，而且具有出色的光稳定性，为后续的荧光成像和生物标记研究提供了有力的工具。
图4 mNeonGreen和mBaoJin在线虫神经元中的特性
参考文献
[1] Zhang, Hanbin, et al. Bright and stable monomeric green fluorescent protein derived from StayGold. Nature Methods, 2024, 1-9. Doi:10.1038/s41592-024-02203-y
[2] Ivorra-Molla, Esther, et al. A monomeric StayGold fluorescent protein. Nature Biotechnology 2023, 1-4. Doi:10.1038/s41587-023-02018-w
[3] Ando, Ryoko, et al. StayGold variants for molecular fusion and membrane-targeting applications. Nature Methods, 2023, 1-9. Doi:10.1038/s41592-023-02085-6
撰稿：卞文印
审核：陈岚彬
编辑：余雯
