神经胶质细胞对自噬和代谢的非自主控制

中枢神经系统感应并加工内部和传入信号，这些信号包括有机体的营养状态和环境压力等信息，动物必须精确地响应这些信号以确保生存。胶质细胞和胶质-神经元接触点是代谢信号整合的关键。神经元系统的信号可以调节寿命和蛋白质稳态，随着年龄增长，细胞对应激的响应能力逐渐减弱。细胞通过多种应激反馈路径来应对损伤和维持蛋白稳态，其中内质网（Endoplasmic Reticulum，ER）在脂质和蛋白合成中起到核心作用。在神经系统中，内质网的应激反应可以影响机体的应激抗性和寿命。通过调节神经递质作用和胶质细胞功能，内质网非折叠蛋白反馈（UPR^ER）激活可以影响生物体的寿命和器官之间的交流。UPR^ER的IRE-1支路可发现内质网的非折叠蛋白以及内质网膜上的脂质扰动，进一步导致编码转录因子XBP-1的mRNA发生调控性剪接。被剪接的XBP-1 mRNA，即XBP-1s，随后发生翻译，通过压制蛋白转录、调节脂质合成的方式导致对其转录靶点的调节。秀丽线虫的四个头部鞘胶质细胞（CEPsh：CEPshDL、CEPshDR、CEPshVL和CEPshVR）有大量与哺乳动物类似的功能。在CEPsh胶质细胞中过表达UPR^ER转录因子XBP-1s，通过释放致密核心小泡（DCV）和神经多肽能够在远端肠细胞中诱导UPR^ER，进而延长寿命并增强ER应激抗性。这些发现表明胶质细胞中部分亚类型能通过神经多肽信号可调节系统的蛋白稳态、器官之间的交流和生物体衰老。但是下游调控这些表型的机制仍然未知。

图 1  四个CEPsh胶质细胞质线虫头部的位置

来自霍华德·休斯医学研究所的Andrew Dillin研究团队发现，在四个CEPsh胶质细胞中组成型异位表达XBP-1s（命名为glial XBP-1s）能启动强烈的代谢程序，促进脂质消耗和外周ER重塑。CEPsh胶质细胞通过非自主信号激活了肠道中的转录因子HLH-30，而HLH-30对溶酶体和自噬动态平衡是十分重要的。有趣的是，HLH-30不仅是glial XBP-1s线虫实现脂质消耗、寿命延长以及蛋白质稳态增强的必要条件，而且在glial XBP-1s线虫中，当HLH-30在外周组织中激活时，肠道中的自噬作用也被激活。glial XBP-1s信号激活外周中的HLH-30依赖于致密核心小泡的释放。总之，Andrew Dillin团队的研究表明，从CEPsh胶质细胞表达的XBP-1s通过细胞非自主信号激活了外周组织的代谢程序，对机体的蛋白质稳态、细胞器健康以及长寿产生了积极的影响。

UPR^ER和XBP-1能够调节脂质代谢，并借此调节寿命。为了确定长寿和具有压力抗性的转基因线虫glial XBP-1s是否改变其外周组织的脂质代谢，作者使用BODIPY 493/503染料衡量线虫全身中心脂质含量。相对于野生型对照，glial XBP-1s线虫的总中性脂质含量显著降低（图2A、B）。这暗示胶质细胞中的UPR^ER激活可导致外周组织脂质贮存。文章同时比较了其他抑制脂质贮存的突变体线虫，例如eat-2(e1372)和daf-7(ad1116)，结果发现分别增加和降低了BODIPY 493/503染色水平。

脂滴是脂肪的存储细胞器，也是线虫肠道脂质的主要贮存位置。作者推测glial XBP-1s线虫中脂滴含量可能会降低，因此使用肠道表达的短链脱氢酶与绿色荧光蛋白融合（dhs-3p::dhs-3::GFP）进行实验观察，其中DHS-3定位于线虫脂滴膜上。结果发现，glial XBP-1s线虫会降低肠道内DHS-3::GFP的荧光强度，并且这种降低程度并非由于基底自发荧光差异造成的。更进一步地，通过衡量肠道成像中每个区域的脂滴数量，作者发现glial XBP-1s线虫具有更少的脂滴密度（图2C-F）。这些数据指出glial XBP-1s线虫的肠道收到来自胶质细胞的UPRER激活信号，导致其脂质含量降低。

作者推测glial XBP-1s线虫脂质含量降低可能是由于溶酶体的脂质分解作用增加所致。此前在上源生科公众号的推文中我们介绍过关于溶酶体蛋白谱影响线虫寿命的文章（传送门：以秀丽线虫为研究对象在长寿条件下揭示溶酶体蛋白组异质性）。溶酶体作为细胞内能量代谢的调节器，不仅承担着细胞内代谢的再循环中心角色，还是决定细胞生长的感应中枢。作者使用与GFP融合的溶酶体表面蛋白LMP-1，即LMP-1::GFP作为报告基因衡量溶酶体密度。结果发现，glial XBP-1s线虫肠道内的溶酶体密度显著增高（图2G、H）。同时，为排除摄食行为减少导致脂质含量降低和溶酶体数量增加的可能性，作者对比了glial XBP-1s线虫与野生型线虫的咽部汲取频率（pumping rates）。结果显示，两者在细菌食物的消耗量上相当。因此，glial XBP-1s线虫肠道溶酶体数量的增加表明，这些线虫具有更高的脂质分解和蛋白稳态活性，这为其脂质含量的降低提供了直接证据。

图 2  CEPsh胶质细胞中表达的XBP-1s调节外周组织的脂质代谢

作为生物膜合成和主要膜脂质生产的中心枢纽，ER对脂质含量变动展现出极高的敏感性，显著改变其结构和功能。UPR^ER激活增加ER的尺寸和折叠容量以重建细胞内稳态。为了测试胶质细胞中的UPR^ER活性是否影响到外周组织ER的形态，作者采用了一个融合蛋白vha-6p::ERss:mRuby:HDEL来可视化观察肠道ER（vha-6p是肠道特异性表达启动子；ERss是热休克蛋白HSP-4信号肽，其特异性地靶向ER腔；HDEL是C末端内质网驻留蛋白的特有序列；mRuby为一种红色荧光蛋白）。

值得注意的是，glial XBP-1s线虫中形成的荧光斑点在野生型对照中并未观察到（图3I）。此外，作者使用VIT-2:GFP报告基因发现，glial XBP-1s线虫增强了肠道中分泌蛋白的能力。VIT-2是卵黄蛋白，由肠道的ER产生并分泌，随后经内吞作用进入卵母细胞，并进一步发育成虫蛋。因此，文章中虫蛋的 VIT-2:GFP荧光强度被用作观察ER功能的间接指标。为了更好地理解glial XBP-1s线虫肠道ER形态和功能的改变，作者使用高倍率透射电子显微镜（high-magnification transmission electron microscopy，TEM）进行观察。结果显示，glial XBP-1s线虫的粗糙ER形态发生改变，形成环形样的结构，而野生型对照ER则呈现网状结构（图3J）。这些结果表明，glial XBP-1s线虫肠道中ER形态发生膨胀性改变，并伴随着分泌蛋白能力的增强。

图 3  glial XBP-1s线虫重塑肠道中ER形态

在本研究中，我们观察到glial XBP-1s线虫展现了一系列特定的表型变化，包括脂肪存储水平和脂滴成分改变、溶酶体数量增加等，这暗示在glial XBP-1s线虫外周组织中存在一个掌控线虫代谢的调节器。作者基于已知的代谢关键调节器，包括daf-16 (FOXO)、aak-1和aak-2 (AMPK)和pha-4 (FOXA)，进行了系统的RNAi敲降实验。结果表明，这些调节器在glial XBP-1s线虫中的代谢调控作用并非主要依赖因素（图4A-D）。有趣的是虽然glial XBP-1s线虫表现出DAF-16水平的升高（通过DAF-16::GFP报告基因进行监测），但是并没有观察到DAF-16的核定位现象增强。

HLH-30是线虫中哺乳动物转录因子EB（TFEB）的同源蛋白，它掌控调节溶酶体的生成、自噬和脂肪分解。作者发现hlh-30(RNAi)压制glial XBP-1s线虫长寿表型，同时使用缺失突变体hlh-30(lof)也能压制glial XBP-1s线虫长寿表型（图4E、F）。这些数据表明是转录因子HLH-30在glial XBP-1s线虫中发挥延展长寿的作用，而并非其他代谢调节器。

图4  筛选glial XBP-1s线虫中调节寿命的关键调节器

只有当有机体处在应激条件下为了满足个体的代谢需求时，HLH-30才被激活。HLH-30处于失活状态时，其通常被支架蛋白扣押在细胞质中，而HLH-30通过磷酸化激活从细胞质转移到细胞核中。作者使用HLH-30::GFP作为报告基因观察在glial XBP-1s线虫中HLH-30核定位的水平。文章指出在glial XBP-1s线虫肠道中观察到显著的核定位富集荧光信号（图5A-C）。这说明在CEPsh胶质细胞中组成型表达xbp-1s导致线虫外周组织肠道中HLH-30的激活。

随后，作者深入探讨了glial XBP-1s线虫肠道中HLH-30的激活机制，以及这种激活是否以细胞非自主的方式发生，或是仅作为UPR^ER激活的副产物。前文我们提到过glial XBP-1s线虫通过致密核心小泡释放的神经多肽传递信号，该信号被肠道检测到并进一步激活UPR^ER。作者使用unc-31(lof)突变体（打乱致密核心小泡胞吐作用）为背景观察glial XBP-1s线虫HLH-30的入核信号，结果表明HLH-30重新由细胞核返回到细胞质中（图5D）。但是利用热激处理unc-31突变体时既没有改变HLH-30定位，也没有阻止其转移入核。

胶质细胞和神经元的XBP-1s的激活信号机制存在显著差异。glial XBP-1s线虫并非通过神经递质或清亮小囊泡（small clear vesicles，SCV）去激活外周组织UPR^ER。为了再次验证这一点，作者使用unc-13(lof)突变体（阻断清亮小囊泡释放），发现unc-13(lof)突变体并不能压制外周组织中HLH-30的激活。这些结果一致表明，glial XBP-1s线虫是利用致密核心小泡传递信号，该信号被肠道检测并进一步增加HLH-30的核定位。

为了探究HLH-30在glial XBP-1s线虫肠道ER活性应激下的激活是否具有细胞自主性，作者采用衣霉素（tunicamycin）处理HLH-30::GFP线虫。因为衣霉素是一种常见的造UPR^ER化合物，其原理是抑制蛋白质糖基化，阻断蛋白质折叠，引起ER应激反应。然而试验结果显示，衣霉素并不能诱导HLH-30核定位（图5E）。此外，使用xbp-1(lof)突变体能显著压制HLH-30核定位。总之，glial XBP-1s线虫是以细胞非自主的方式将信号传递到外周组织中，并且这个信号一定来自胶质细胞。

那么HLH-30是否可以通过细胞非自主的分子自激活呢？作者在四个CEPsh胶质细胞中过表达HLH-30，但是既没有观察到外周组织中HLH-30核定位，也没有观察到该线虫寿命增加，但是全身表达HLH-30可延长寿命并诱导HLH-30靶基因表达。上述数据表明在CEPsh胶质细胞中表达xbp-1s能特异性地激活外周组织中的HLH-30，并延长寿命。

图 5  glial XBP-1s线虫以细胞非自主的方式激活肠道HLH-30

鉴于HLH-30作为一个关键转录因子，在glial XBP-1s诱导的长寿效应中占据着起始位置，调控下游基因表达。为了深入理解HLH-30如何以独特方式作用于下游通路，研究进一步探讨了在外周组织中观察到的转录和表型变化是否部分或完全是由HLH-30所介导。RNA-seq反映出在glial XBP-1s线虫中有大量的基因表达发生了改变，其中有超过1/3上调的基因是HLH-30转录靶点（图6F）。为了验证这些变化是否确实由HLH-30调控，作者列举了一组已知的HLH-30靶基因。在glial XBP-1s线虫的86个上调的基因中，有36个被确认是HLH-30的靶基因。这些基因的作用包括溶酶体脂质和蛋白质分解、抗氧化产物的产生、免疫反馈调节和UPR^ER等多个方面。另外，作者发现部分glial XBP-1s上调的相关基因在hlh-30(lof)突变体中至少部分地被抑制了（图6G）。这些结果强有力地表明，在CEPsh胶质细胞中组成型表达xbp-1s能够激活外周组织的特定代谢程序，这个激活过程部分是由外周组织中的HLH-30调控的。

图 6  glial XBP-1s线虫中HLH-30调控的基因涉及脂质分解和溶酶体生成

HLH-30在自噬过程中展现出了其关键作用，主要是通过调节大量与自噬和溶酶体相关的基因来实现。我们上文中提到HLH-30在glial XBP-1s线虫的外周组织中被激活，作者推测其结果可能增强glial XBP-1s线虫肠道中的自噬活性。为了验证这一假设，作者首先着眼于glial XBP-1s线虫中自噬体（autophagosome，AP）和自噬溶酶体（autolysosome，AL）的含量变化。这里作者使用与LGG-1融合的双荧光报告基因，即mCherry::GFP::LGG-1确定自噬体和自噬溶酶体的数量。Lgg-1是哺乳动物Atg8在线虫中的同源蛋白，在自噬体形成过程中LGG-1被裂解后与磷脂酰乙醇胺结合并嵌入自噬体膜中。串联的mCherry/GFP可以用于有效地区分自噬体和自噬溶酶体，在自噬体与溶酶体融合前，mCherry和GFP在自噬体上均能发出荧光，经叠加后呈现出黄色；之后自噬体与溶酶体发生融合，由于GFP对酸性环境的敏感性，其荧光发生猝灭，此时仅mCherry呈现红色，标志着自噬溶酶体的形成；最后mCherry和GFP均被降解，荧光消失（图7）。

图 7  mCherry::GFP::LGG-1报告基因工作原理（Chang JT, et al. Elife. 2017;6:e18459.）

glial XBP-1s线虫和野生型对照在day 2和day 5的比较中，自噬体密度没有差异；但是自噬溶酶体密度均高于野生型对照（图8A、B）。并且通过RNAi试验进一步验证，glial XBP-1s线虫中自噬体和自噬溶酶体的数量变化确实取决于hlh-30的表达。为了确认上述线虫体内的自噬诱导分析结果，作者通过qPCR验证glial XBP-1s线虫中由HLH-30诱导的自噬与溶酶体相关靶基因的表达水平。结果显示hlh-30、自噬相关和溶酶体相关的基因转录水平确实显著增加。上述结果表明随着线虫衰老，CEPsh胶质细胞中xbp-1s的表达以细胞非自主的方式激活线虫肠道自噬。

为了验证glial XBP-1s线虫激活外周组织自噬是通过致密核心小泡的释放这一机制，作者使用qPCR以unc-31突变体为背景验证HLH-30相关的靶基因表达，结果表明这些基因在unc-31突变体中的表达确实上调了。但是这个结果似乎缺少一些说服力，因为文章指出unc-31突变体会打乱包括胰岛素信号在内的神经多肽信号，该信号也能激活线虫中的自噬（因此，这里可能使用RNAi或者AID（auxin-inducible degradation）组织特异性干扰unc-31的结果更具有代表性）。

图 8  glial XBP-1s促进外周组织自噬激活

上文中我们提到HLH-30转录调控多个涉及溶酶体生成和脂质代谢的相关基因，那么在glial XBP-1s线虫中降低脂质含量的效果是否取决于hlh-30？在hlh-30(RNAi)试验中发现，肠道中的脂滴荧光密度（dhs-3p::dhs-3::GFP作为报告基因）与野生型的相当（图9D、F），说明glial XBP-1s线虫中肠道内脂滴的贮存取决于hlh-30。

在线虫泛神经元中过表达xbp-1s的研究中，作者探讨了HLH-30在保护由蛋白聚集引起的毒性方面的必要性。文章采用了polyQ-YFP（polyglutamine，亨廷顿病）线虫模型，观察glial XBP-1s线虫是否能显著降低肠道中的蛋白聚集。结果表明polyQ在肠道中的聚集显著降低，并且这些效果依赖于hlh-30（图9F、G）。

图 9  HLH-30可降低glial XBP-1s线虫脂滴和肠道内蛋白聚集

自噬活性有助于延缓衰老并增强多种保守的长寿效应。我们上文中提到在glial XBP-1s线虫中有自噬相关的基因表达量上调。因此，作者又验证glial XBP-1s线虫的长寿效果是否与这些自噬基因相关。文章对诱导巨自噬的相关基因bec-1和agt-18进行RNAi，结果发现bec-1(RNAi)和agt-18(RNAi)均废除了glial XBP-1s线虫延长寿命的效果（图10H、I）。

脂肪代谢是通过脂滴的自噬降解驱动的。在glial XBP-1s线虫中观察到膨胀的溶酶体形态、HLH-30靶向的脂质分解基因上调和依赖于hlh-30的肠道脂质消耗现象。作者推测脂质的消耗可能是由于脂滴的巨自噬作用引起的。bec-1(RNAi)试验中，glial XBP-1s线虫脂滴消耗的表型被强烈抑制（图10J、K）。

图 10  巨自噬是glial XBP-1s线虫延长寿命和脂滴消耗是必须的

在观察到自噬激活与hlh-30激活的同时变化后，在glial XBP-1s线虫中ER形态的改变是否与自噬有关呢？内质网自噬（ERphagy）是细胞选择性地依靠自噬清除内质网的过程，其在维持ER稳态以及ER从应激状态中的恢复中发挥重要作用。作者发现RNAi敲降巨自噬机器的核心成分，包括atg-18、vps-34、bec-1和lgg-1，可显著抑制在glial XBP-1s线虫肠道中ER斑点的形成（图11A、B）。这一发现说明在glial XBP-1s线虫肠道中ER的结构取决于巨自噬的活性。

随后，作者进一步观察这些ER斑点是否与溶酶体和自噬体共定位。利用mRuby::HDEL标记ER斑点，并结合LysoTracker（一种在酸性溶酶体中聚集的pH依赖的染料），结果显示在glial XBP-1s线虫中两者高度重合（图11C、E）。通过LGG-1::GFP标记自噬体膜，同样发现ER斑点和自噬体在glial XBP-1s线虫中也高度重合（图11D、F）。先前在高倍率透射电子显微观察到的环形ER结构，其结果是否取决于自噬激活呢？作者在glial XBP-1s线虫中敲降bec-1，在高倍率透射电子显微镜下发现，bec-1(RNAi)中ER的形态与野生型对照相似（图11G）。总之，作者认为在glial XBP-1s线虫中ER形态发生改变，并且这种改变依赖巨自噬成分，并且与溶酶体和自噬体共定位有关。

图 11  巨自噬基因改变glial XBP-1s线虫ER结构以及自噬体和自噬溶酶体共定位

文章中Andrew Dillin研究团队发现，在神经胶质细胞组成型表达xbp-1s，并通过胞吐作用利用神经多肽以细胞非自主的方式诱导激活外周组织UPR^ER和转录因子HLH-30。这种激活过程不仅促进了glial XBP-1s线虫脂质分解和溶酶体生成相关基因表达，还显著增强了脂质分解、激活自噬、降低肠道蛋白聚集、延长寿命以及ER重塑（图12）。这些数据为我们深入理解神经胶质细胞在应激状态下如何以非自主方式影响外周组织的自噬和代谢适应提供了新的视角。文章同时使用了多种报告基因，并向我们展示研究自噬、溶酶体的部分方法，值得学习使用。最后，文章也有些悬而未决的问题，例如神经多肽在什么过程发挥作用，肠道细胞上的什么受体感应到来时神经胶质细胞信号以及下游通路是什么，这些有待于深入挖掘。

图12  glial XBP-1s作用于外周组织代谢和自噬