用秀丽线虫实验验证医用麻醉剂对学习和记忆的影响

作者将同步化至L1时期的线虫置于含/不含10μM异丙酚平板中处理3h，然后用M9洗涤线虫3次，转移至含OP50平板中，养至L4大小，接着进行厌恶嗅觉训练和运动行为分析。

厌恶嗅觉训练：将特定时期的线虫置于无食物的NGM平板上，并用异戊醇（IAA）训练一定时间，使线虫对IAA产生厌恶联想（图1）。正常情况下，IAA对未经训练的野生型线虫有很强的吸引力。

运动行为分析：挑取单只经过厌恶嗅觉训练的线虫，放到无菌平板上适应2min，当线虫开始向前爬行一段时间后，在其前进方向放置一个浸泡过IAA的丝带，如果线虫停在丝带旁边，并在3秒内撤退，这种行为被称为“躲避”。短暂停止或继续向前穿过丝带的判定为“无躲避”行为（图2A）。从实验结果得知：L1时期线虫暴露于异丙酚，并在IAA训练后，其躲避IAA能力明显低于未暴露于异丙酚的线虫。说明早期暴露于异丙酚，可能会改变其学习能力（图2B）。

图1  厌恶嗅觉训练流程

图2  运行行为分析示意图及实验结果

随后，作者尝试了不同浓度异丙酚暴露的时间梯度实验，并通过趋化指数来反映其学习能力。实验发现：异丙酚浓度越高，暴露时间越长，经IAA厌恶嗅觉训练后，线虫对IAA的厌恶程度越低（即趋化指数高），说明线虫的学习能力，与异丙酚暴露以时间和剂量依赖的方式在降低（图3左）。

图3  左：将线虫暴露于0、10、50、100 μM浓度的异丙酚中，分别处理1h、2h、3h、5h、10 h，Naive代表未经IAA训练的野生型线虫。    右：趋化分析平板示意图

上述结果可知，影响线虫厌恶嗅觉学习能力的异丙酚最小浓度为10μM。作者采用该浓度处理线虫1h、3h、5h，并利用HPLC法测定了线虫体内异丙酚的浓度。结果提示：线虫体内异丙酚浓度，随暴露时间延长而增加（图4）。

图4  10μM异丙酚暴露时长与线虫体内异丙酚浓度的相关性

 那么，如果同样采用10μM异丙酚暴露3h，IAA训练时长不同，会影响线虫学习能力吗？实验结果显示，随着训练时间的延长，线虫的趋化指数逐渐下降。将训练时间延长至12 h后，异丙酚处理组与未处理组之间无显著性差异。这表明，异丙酚是通过降低线虫的学习速度，而非使其丧失学习能力（图5）。

图5   10μM异丙酚暴露3h后，IAA训练时间梯度的趋化指数变化

为了探究异丙酚暴露对线虫长期记忆的影响，作者将同步化的L1时期线虫暴露于10μM异丙酚3h，并用IAA训练24h，随后置于含食物的NGM平板恢复不同时间后，进行趋化分析。实验显示：经过12h恢复后，异丙酚处理组线虫的趋化指数显著升高，提示线虫记忆能力的下降，异丙酚加快了线虫的遗忘速度（图6）。

图6  异丙酚诱导记忆衰减与时间的相关性

异丙酚引发线虫长期联想记忆损害，其抵抗胁迫的能力也会受影响。当L1时期的线虫有/无暴露于10μM异丙酚3h，并用IAA训练24h，随后置于含食物的NGM平板恢复4h，有/无再次使用IAA进行训练。通过观察性腺鞘细胞的荧光发现，无异丙酚处理组线虫（c-trained），经过IAA训练后，其DAF-16/FOXO在20min内就会被诱导快速入核（图7）。随后，作者测定了几个DAF-16/FOXO依赖的应激反应基因的水平，发现mtl-1基因在气味诱导的记忆重新激活后表达量显著上调（图8左）。

由气味引发的应激反应，可通过应激胁迫下的存活率来衡量。有/无再次使用IAA训练的线虫，置于37°C条件下热激一定的时长，我们可以发现，无异丙酚处理组（c-trained）线虫比异丙酚处理组（p-trained）线虫的存活率明显提高（图8右）。因此，作者认为异丙酚会导致联想性长期记忆的损害。

图7  TJ356线虫的性腺鞘细胞中DAF-16/FOXO的入核情况

（红色圆圈代表DAF-16/FOXO已入核的细胞数量）

图8  左：DAF-16/FOXO依赖的基因表达量变化  右：有/无异丙酚处理线虫在应激胁迫下的存活率差异

在探究异丙酚对学习和记忆力影响的机理过程中，作者发现在L1期暴露于异丙酚的线虫经厌恶嗅觉训练后，AWC神经元中EGL-4::GFP的重新定位失败，因野生型线虫经IAA训练后，EGL-4会从AWC神经元的细胞质迁移至细胞核中（图9）。同时，未经厌恶嗅觉训练的异丙酚处理组的线虫rgs-3表达显著上调。对暴露于异丙酚的线虫同时进行rgs-3的RNA干扰，能诱发EGL-4的重新定位（图10），并能明显改善线虫的学习能力（图11 D-E）和记忆功能（图12）。

图9  IAA训练前后EGL-4在AWC神经元中的核富集情况

图10  rgs-3基因的RNAi 促使EGL-4的重定位

图11  rgs-3基因的RNAi对异丙酚处理的线虫的学习能力影响

图12  rgs-3基因的RNAi对异丙酚处理的线虫的长期记忆的改善作用