线虫中的miRNA功能

microRNAs（miRNAs）是一种小的非编码RNA（~22nt），是后生动物中转录后基因表达的重要调控因子。装载miRNAs的Argonaute蛋白与许多其他蛋白相互作用，形成miRNA诱导的沉默复合物（miRISCs），它能够通过翻译抑制或降解miRNAs的靶点。miRISC的关键组成部分之一是支架蛋白GW182，它与Argonaute蛋白、poly-A结合蛋白和去烯化复合物相互作用。GW182被招募到目标mRNA上，导致靶mRNA的翻译抑制和衰减。一些Argonaute蛋白具有核糖内切酶功能，使它们能够直接切割靶标，如植物miRNA与靶标的相互作用；然而，这一现象在动物miRNAs中并不具有典型性。

miRNAs源于母体，在发育早期表达，在每个动物组织中都有发现。因此，基于miRNA的基因调控很可能影响细胞发育和功能的几乎每个方面。miRNA家族成员的功能冗余性使得很难确定单个miRNA对基因表达的确切贡献。基于3’utr的种子互补性和结合位点保守的miRNA靶点的生物信息学预测表明，单个miRNA调控数百个基因；然而，验证miRNA-靶点相互作用却是一个持续性的挑战。

在秀丽隐杆线虫中，多个Argonaute蛋白与miRNA相关。ALG-1、ALG-2、ALG-5和RDE-1是与miRNA结合最明显相关的Argonaute，它们是维持与其相关的miRNA稳定性所必需的。在这些Argonaute蛋白中，ALG-1和ALG-2具有基本相似的氨基酸序列，在体细胞组织中表达模式大多重叠。在性腺和头部神经节的一些神经元中仅表达ALG-2，而咽部主要表达ALG-1。ALG-5的表达仅限于性腺，对野生型线虫的生育能力至关重要。RDE-1启动子在性腺和体细胞组织中都具有活性。

单个miRNAs在Argonaute蛋白中差异富集；大多数miRNAs被装载到ALG-1、ALG-2和RDE-1中，而一小部分的miRNAs被优先装载到ALG-5中。将miRNA加载到RDE-1中的决定因素之一是pre-miRNA序列中错配碱基对的数量；RDE-1结合的miRNA具有更少的错配碱基对。许多与RDE-1结合的miRNAs在线虫物种中并不保守，这表明最近进化的miRNAs与RDE-1相关。ALG-1、ALG-2冗余地执行最基本的miRNA功能；这两个基因的失活都是致命的。RDE-1的关键功能在于它能够响应外源性的双链RNA（dsRNA）信号，从而触发RNA干扰（RNAi）过程。

最初发现的miRNAs在线虫中的作用是调节幼虫期之间过渡所需的基因表达变化。随后，miRNAs被证明可以调节神经元的左右不对称性、RNAi 、衰老、进入dauer期、生殖、性别决定、先天免疫系统等许多其他过程。尽管大多数miRNA家族在基因调控中具有广泛的作用，但它们对线虫的胚胎发育并不是必需的。只有mir-51和mir-35的miRNA家族对胚胎发生是必不可少的。

mir-35家族是研究最多的miRNA家族之一，有一些已验证的靶点，包括egl-1、sup-26、nhl-2和ndk-1。mir-35对sup-26的调控影响了胚胎对缺氧环境的反应能力，而sup-26和nhl-2在性别决定通路中mir-35-42的下游起重要作用。在性腺中，mir-35介导的egl-1和ndk-1的抑制，可限制由DNA损伤引发的凋亡。通过multiplexed CRISPR筛选（图1F），确定egl-1是mir-35的一个关键靶点：单独抑制egl-1会导致中度胚胎致死率和降低生殖力。尽管这些研究一致表明了egl-1的重要性，但它们同时也揭示了mir-35家族中尚有其他关键靶点未被确定。尽管CRISPR技术可能会在未来拓展我们对该家族靶点认知的边界，但目前已知的是，对于mir-51家族而言，cdh-3和glo-4是其关键靶点。

图1  通过CRISPR技术对miRNA靶点进行鉴定和验证

miRNAs lin-4和let-7在调控发育时序上发挥着至关重要的作用。通过深入探索它们所调控的基因网络，我们发现let-7通过调控lin-41，参与了多个性别特异性发育的过程。其一，对lin-41的抑制及对下游靶点的激活，引导表皮发育的时空顺序和vulva的完整性；其二，通过激活特定的雄性特异性lin-41靶点来指导雄性性器官的发育。在神经系统方面，一些神经元性别二型性的产生也是由let-7对lin-41的性别特异性作用的抑制所介导的。在PVD神经元中，lin-4和let-7的作用分别决定了树突分枝开始和结束的时间。

mir-48，mir-84和mir-241作为let-7的姐妹，在调控hbl-1以促进L2幼虫向L3幼虫发育的过程中扮演着关键角色。它们通过LIN-46来调节HBL-1的亚细胞定位，协助完成对HBL-1的抑制。然而，对于dauer的形成，这种依赖于LIN-46、不依赖于miRNA的hbl-1抑制（通过DAF-12通路）显得尤其重要。

通过miRNA进行转录后基因调控，可以快速响应变化的条件。同样，许多应激条件也会造成miRNA表达的变化，比如尼古丁暴露，氧化应激，热应激，饥饿，病原体感染等。

最近的研究主要集中在热应激情况下miRNA的作用。热应激导致大多数miRNA的下调，这种下调与ALG-1水平的降低相一致。然而，特定的miRNAs受到选择性的影响（表1），热应激反应中的某些miRNAs突变体，在暴露于热应激条件下时其寿命和运动性下降（图2）。

表1  受热应激调控的19个miRNA

图2 热激情况下，miRNA缺失突变体对寿命的影响

此外，据了解HSP-70在热应激过程中被上调100倍，在热应激恢复过程中，需通过mir-85下调HSP-70的表达量，线虫才能获得最佳生存能力（图3）。

图3  mir-85在调节hsp-70中的作用模型

秀丽隐杆线虫是研究衰老的一种极好的模型生物，因为它们的寿命相对较短，有明确的衰老表型，如生育能力和运动性能下降，以及神经退行性变。早期的研究表明，miRNA lin-4除了在幼虫发育中发挥良好的作用外，还能延长寿命。

最近的研究表明，突变alg-1或alg-2导致相反的衰老表型；alg-1的突变导致寿命缩短，而alg-2的突变增加寿命。ALG-1的表达水平在L4期之后下降，而ALG-2的表达水平在整个成年期保持不变。在衰老的线虫中，ALG-1的下调至少部分是由于mir-71介导的，mir-71在衰老的线虫中表达增加，并靶向alg-1的3’UTR。

衰老的特征之一是自噬的广泛减少，这在较长寿的突变体中以组织特异性的方式被阻止。Zhou等人在2019年发表的研究中表明，miRNA是调节组织特异性自噬的机制之一。具体来说，mir-83在神经元和肠道中表达，并在衰老过程中在肠道中表达增加。mir-83的表达是由hsf-1诱导的，hsf-1在衰老线虫的肠道中上调，而mir-83突变的线虫增加了肠道自噬和寿命（图4）。自噬相关基因cup-5（调节肠道自噬）被确定为mir-83靶点。

图4  mir-83调节肠道内的自噬（箭头指示肠道内自噬体）

miRNAs的组织特异性作用与发育、免疫反应、蛋白稳态、运动、代谢、生育和行为密切相关。最近的一项研究应用了一种基于免疫沉淀的方法来识别体壁肌肉、神经元和肠道中的组织特异性miRNA靶点。剪接因子在这些组织之间受到miRNA的差异调控，miRNA活性对组织特异性选择性剪接有一定影响（图5）。

图5  miRNA在调节组织特异性选择性剪接中的作用。

RNA剪接因子（黄色圆圈）的丰度决定了tissue A中的剪接事件。tissue B中存在miRNA可能会降低这些剪接因子的剂量，从而导致组织特异性选择性剪接。

miRNA表达的精细组织特异性往往决定了其功能。例如mir-791，它在三对负责检测二氧化碳和逃逸行为的神经元中特异性表达。mir-791通过对其靶基因akap-1和cah-3的调控，使线虫能够对CO₂产生相应的反应行为。

mir-71的长寿作用大部分是由于其对AWC神经元中的桥和白细胞介素受体tir-1的调控。敲除tir-1 mRNA中的mir-71结合位点，可以复现mir-71突变体的表型（破坏蛋白稳态，缩短寿命）。mir-71在AWC中调控tir-1，是通过神经肽信号传导到肠道，改变蛋白稳态以应对不同的食物来源。

另一个组织特异性miRNA是mir-1，它在肌肉细胞中特异性表达。mir-1能调节体壁肌肉的自噬，mir-1功能缺失线虫呈现poly-Q的积累增加，α-突触核蛋白聚集，以及对热应激的敏感性增加（图6）。mir-1对肌肉自噬的影响是由Tre-2/Bub2/CDC16（TBC）Rab GTPase激活蛋白TBC-7介导的，该蛋白在体壁肌肉细胞中的过表达导致mir-1功能丧失。

图6  mir-1功能缺失诱导poly-Q的聚集增加

mir-44家族的miRNA家族对线虫的生育能力至关重要。这个miRNA家族的单个突变体增加了胚胎和成虫的致死率。该家族多个成员突变的线虫，由于精子产量减少导致排卵率下降。精子产量的减少，与精子产生开始的延迟以及精子产生的过早结束有关。然而，其确切的发生机制尚未清晰。

线虫中的miRNA具有多种重要功能，这些功能主要体现在对基因表达的调控上，并涉及多种生物过程。虽然目前关于线虫中miRNA与疾病关系的研究相对较少，但已有研究表明miRNA失调与多种人类疾病相关。因此，研究线虫中的miRNA也可能为理解人类疾病的发生和发展提供新的线索。随着研究的深入，我们有望更加全面地了解miRNA在线虫以及其他生物体中的功能和作用机制。