在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans，简称线虫）转基因实验中，如何从大量个体中快速、准确地筛选出携带目标遗传改变的虫株，是决定实验效率与成败的关键环节之一。报告标记通过与目的质粒共同显微注射进入线虫生殖系，为阳性个体的识别提供直观的遗传或荧光表型依据。本文基于上源生科日常实验体系，梳理常用筛选/报告标记质粒的基本信息、适用场景与选型逻辑，供初次接触线虫基因编辑的研究人员参考。
一、报告标记的定义及作用
什么是报告标记？
在秀丽线虫转基因实验中，报告标记是指与目的质粒共同导入线虫生殖系，用于快速鉴定和筛选转基因阳性个体的表型标记。依据标记特征（运动表型、遗传缺陷拯救或荧光信号），研究人员可在体视显微镜下快速识别阳性个体，显著降低人工筛选的工作量。
报告标记的主要作用
大幅减少人工筛选工作量，提升挑虫效率；
辅助获得遗传稳定的转基因线虫株系；
可根据不同实验设计灵活搭配，适配不同实验场景。
概念辨析：筛选标记与报告标记
在 CRISPR-Cas9 等编辑实验中，“报告标记”与“筛选标记”是两个常被混用但内涵不同的概念：报告标记用于确认显微注射操作成功，通常在注射后 F1 代中观察其荧光或表型；筛选标记则用于在后续世代中筛选携带目标编辑的阳性个体。实际操作中，多数报告质粒同时承担两种功能，但理解二者的区别有助于正确解读筛选结果。
不少实验操作人员常会遇到选型难题：Roller表型标记、Unc缺陷拯救标记、红绿荧光标记该如何组合？不同实验场景下哪种质粒筛选效率更高？下文分场景详细说明。
二、上源生科常用的报告标记质粒基础信息
表1 上源生科常用报告标记质粒基本信息
三、不同实验目的下的报告标记选择方案
方案1：基于形态学的无荧光依赖筛选——首选 rol-6(su1006)（pRF4）
适用场景：常规外源质粒显微注射（B001-游离转基因线虫、B002-整合转基因线虫）、CRISPR-Cas9基因编辑（以质粒为修复模版）等实验。
l 核心优势rol-6(su1006) 为显性遗传标记，质粒成功表达后，子代线虫直接呈现 Roller 卷曲表型（如图1），仅靠体视镜肉眼观察即可分辨，无需荧光仪器，使用成本低。
l 弊端：Roller表型源于运动相关基因的显性改变，若后续实验需检测线虫运动、行为表型；或转基因线虫需要作为雄虫进行杂交实验不建议使用该报告标记。
图1 线虫Roller表型（pRF4）
方案 2：无干扰、低背景的稳定株构建——首选unc-119拯救标记
l 适用场景：常规外源质粒显微注射（B001-游离转基因线虫、B002-整合转基因线虫）、MosI单拷贝插入等需长期传代保种的稳定编辑株构建。
原理： 以unc-119(ed3)或unc-119(ed9)突变体为亲本，其表型为Uncoordinated运动障碍表型（如图2）；注射入带有野生型Cb-unc-119(+)的质粒（pCFJ350）后，转基因线虫恢复野生型运动能力，即通过Unc表型拯救实现阳性筛选。
图2 unc-119(ed3)线虫Unc表型和挽救表型
核心优势：标记元件为功能基因（Cb-unc-119），不额外引入外源荧光或表型干扰。标记基因表达对线虫发育、运动、衰老、神经表型无明显干扰，适用于后续功能验证实验；
局限性：当背景线虫不带有unc-119(ed3) 或unc-119(ed9)等位基因时，需要通过杂交构建带有unc-119(ed3)或unc-119(ed9)的线虫进行注射，材料准备流程更长。
同类无干扰拯救标记补充选型：
l unc-76(wt)标记：挽救unc-76(e911) 的Unc表型。
l pha-1(wt)标记：挽救pha-1(e2123)的温度敏感表型。
方案 3：基于荧光可视化筛选，分全身标记、低干扰泛组织特异性标记、细分亚群组织特异性标记
（1）全身广谱细胞核荧光标记（如图3）
l 绿色通道： Psur-5::sur-5::NLS-GFP
l 红色通道： Psur-5:: sur-5::NLS-wrmscarlet
l 适用场景：常规外源质粒显微注射（B001-游离转基因线虫、B002-整合转基因线虫）、CRISPR敲入时的筛选标记（以质粒为修复模版），注射成功后，F1个体能观察到全身细胞核荧光，信号均匀稳定。
选型要点：当目的基因携带荧光标签时，应选择与目的荧光蛋白发射光谱不同通道的标记（如目的序列带有红色荧光，则选择GFP类标记Psur-5:: sur-5::NLS-GFP），以避免荧光信号干扰；反之亦然。
图3 周身表达绿色荧光蛋白的线虫（Psur-5:: sur-5::NLS-GFP）
（1）低干扰组织特异性荧光标记（咽部 / 肌肉组织）如图4图5：
l 咽部标记：Pmyo-2启动子（Pmyo-2::gfp/Pmyo-2::mCherry）
l 体壁肌肉标记：pCFJ104（Pmyo-3:mCherry）
l 适用场景：普通外源质粒显微注射（B001-游离转基因线虫、B002-整合转基因线虫）、CRISPR敲入（以质粒为修复模版）的筛选标记等，咽部特异性表达荧光，信号均匀稳定。具体选择哪一种可以根据实验本身的目的，若观测体细胞/生殖细胞的荧光表型，优先选咽部特异的Pmyo-2::荧光标签标记，通过空间隔离避免目标信号观测受限。
图4 头咽部表达绿色荧光蛋白的线虫（Pmyo-2::gfp）
图5肌肉组织表达绿色荧光蛋白的线虫（Pmyo-3::GFP）
（3） 细分研究场景专属组织特异性荧光标记
针对神经生物学、发育生物学等细分方向的靶向编辑实验，可直接选用对应亚群特异性的荧光标记，完全规避筛选标记信号和目标观测区域的串扰，进一步提升筛选和后续成像的准确性：
l 表皮专属标记：Pcol-12::DsRed，特异性在线虫表皮层表达红色荧光，不干扰内部组织的目标荧光观测（如图6）。
图6 线虫表皮层表达红色荧光（Pcol-12::DsRed）
l 体腔细胞专属标记：coel::RFP(Punc-122::RFP)，仅在线虫体内6个体腔细胞中表达红色荧光，背景干扰极低。适用于需要尽可能降低筛选标记全局表达影响的实验（如图7）。
图7 线虫体内6个体腔细胞中表达红色荧光（Punc-122::RFP）
l 多巴胺神经核特异性标记：Pdat-1::GFP::unc-54 3’UTR，荧光定位于多巴胺神经元（如图8）。
图8 线虫多巴胺神经元表达绿色荧光（Pdat-1::GFP::unc-54 3’UTR）
尾部定位标记：Plin-44::gfp，表达在P6.pa、P6.pp、锚定细胞、直肠上皮细胞和尾部。线虫尾部区域荧光比较亮，辨识度极高，可快速在体视镜下定位阳性个体。适用于线虫发育极性、尾部细胞谱系追踪相关实验的高效筛选（如图9）。
图9 线虫尾部区域表达绿色荧光（Plin-44::gfp）
l GABA能神经元专属标记：Punc-47::GFP，特异性靶向标记GABA能神经元亚群。适用于神经递质调控、运动抑制通路相关研究的编辑株筛选，可精准区分特定神经亚群，避免泛神经标记带来的信号冗余（如图10）。
图10 线虫GABA能神经元亚群表达绿色荧光（Punc-47::GFP）
l 泛神经元红色标记：Prab-3::mCherry，在全神经元中稳定表达mCherry红色荧光，当目的基因携带绿色荧光标签时选用该标记，可实现筛选标记信号与目的信号的通道分离，无串扰风险（如图11）。
图11 线虫全神经元中稳定表达表达绿色荧光（Prab-3::GFP）
三、报告标记的必需性评估
在常规的秀丽线虫转基因实验中，报告标记并非绝对必需，以下几种情况下可以选择不加筛选标记。
目的质粒注射后或基因编辑后产生显著的形态学表型（如显性遗传Dpy、Unc等），可直接通过表型筛选。
目的序列本身包含荧光蛋白标签，且表达后的荧光在荧光体视镜下可见，可直接通过目的荧光筛选。
四、适用性声明
报告标记的使用方案最终取决于您的具体实验体系。本文旨在为初学者提供知识梳理与框架参考，不能替代您结合本实验室实际情况所做的最优决策。建议将这份资料作为实验规划的初步参考，具体实施方案仍需结合相关文献与实验验证谨慎确定。
撰稿：袁巧红
审核：赵培
编辑：蔡晨星
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