导语： 初涉秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）研究的科研工作者在选择荧光信号插入序列时常面临以下困扰： 1、进行活体荧光示踪时，如何挑选亮度高、抗光漂白、且在线虫体内表达稳定的荧光蛋白？ 2、开展多色共标实验中，如何规避光谱串色，避免成像数据报废？ 3、想验证蛋白互作，却找不到适配线虫的双分子荧光互补系统？ 针对上述问题，本文系统梳理上源生科现有插入序列资源及其适用场景，供您参考。
一、上源生科现有插入序列资源
以下序列及相关信息均可通过 Addgene 官网查询：https://www.addgene.org/
1. 多色荧光报告蛋白 1、单荧光报告蛋白 *：Venus/YFP 为常规黄色荧光蛋白，本身不具备光转换特性，仅因常与光遗传学（光控）实验搭配使用而归入本类，便于选型参考；本类中真正可实现绿至红光不可逆光转换的是 Dendra2。 图1 BiFC系统示意图 BiFC系统的N端和C端两个片段动辄上百个氨基酸，大标签容易干扰融合蛋白本身的折叠、定位甚至互作界面，因此拆分荧光互补系统应运而生。 2、 蛋白质互作示踪 2.1双分子荧光互补系统 双分子荧光互补（Bimolecular Fluorescence Complementation，BiFC）系统是一种研究活细胞蛋白质间相互作用的技术。其核心原理是将一个完整的荧光蛋白（如GFP、YFP、mCherry、Venus）在特定位置拆分成两个无荧光活性的片段（通常为N端和C端），分别于两个目标蛋白融合。当两个蛋白相互作用时，N端和C端就会被拉到一起，重新组装成完整荧光蛋白，恢复荧光。目前被广泛应用的是Venus的“VN173 + VC155”组合。VN173片段包含venus的1-172氨基酸，VC155片段包含Venus的155-238氨基酸（并带有一个A206K点突变，用来降低荧光蛋白单体之间的非特异性二聚化）。 图1 BiFC系统示意图 BiFC系统的N端和C端两个片段动辄上百个氨基酸，大标签容易干扰融合蛋白本身的折叠、定位甚至互作界面，因此拆分荧光互补系统应运而生。 2.2拆分荧光互补系统 与经典的 Venus（VN/VC）对半拆分 BiFC 系统不同，将超折叠GFP（Super Fold GFP, sfGFP）在第10和第11条β折叠片之间切开，得到一个含214个氨基酸的大片段GFP1-10，和一个只有约16个氨基酸的小肽GFP11。GFP11小到几乎像一个短表位标签，对融合蛋白的干扰极小。 GFP1-10/GFP11系统不但可以检测蛋白互作，更重要的是可以标记内源蛋白。尤其在CRISPR/Cas9编辑系统被发现后，把16个氨基酸的GFP11通过CRISPR介导的同源重组敲入到内源基因位点，实现内源性蛋白的荧光标记。 细胞中稳定表达的GFP1-10与被敲入的GFP11互补后点亮目标蛋白，既保留了全长GFP的亮度，又避免了在基因组里插入全长GFP大标签，防止干扰面对蛋白折叠、定位。并且串联多个GFP11还可以按比例放大信号，使低表达水平蛋白的可视化得以实现。 通常第11号β折叠片片段（FP11）通常会串联1～8个重复拷贝来线性放大信号，其中GFP11的×1、×3、×7和sfCherry11的×1、×4是最常用的组合，wrmScarlet11则以×3串联为主。 每个FP11拷贝都可以独立招募一个1-10大片段，重组装出一个完整的β桶荧光单元。单一FP11只有16个氨基酸，亮度有限，串联重复是最直接的信号放大手段——而且荧光强度与重复次数基本成正比。当目标蛋白上串联了n个FP11时，就有n个荧光"灯泡"同时点亮，信号近似线性放大约n倍。 绿色低背景系统：GFP1-10 /GFP11×7 该不对称拆分系统专为低丰度表达蛋白的互作验证设计，极小的 GFP11 肽段几乎不干扰目标蛋白的正常折叠与功能，兼容性好，是线虫领域广泛应用的经典拆分绿色荧光系统。 · 红色低背景系统：wrmScarlet1-10/11×3 其红色通道本底噪声显著低于绿色体系，互作阳性信号的信噪比表现更优。 3、生化标记蛋白 TurboID / UltraID：TurboID 属于酶促邻近标记蛋白这一大类，与 BioID、miniTurbo、APEX2 同属一个家族，基于邻近标记原理的生物素标记工具，用于捕获线虫体内瞬时或弱相互作用蛋白。其中 TurboID 含线虫优化内含子，体内标记活性高；UltraID 不含内含子，本底更低。 MiniSOG：miniSOG 作为光敏器，能把光信号转换为电镜对比度，是电子显微镜级别的遗传编码标记与光遗传效应器。也可以作为荧光蛋白，Ex 447 nm / Em 501 nm，呈青绿色荧光。 HaloTag：Halo是一种自标记酶标签，末端可以连接几乎任何功能分子。支持活体实时染色与固定后多重染色，适用于长时程追踪蛋白动态。 4、功能调控标签（检测 / 调控蛋白功能） 5、通用辅助插入片段 柔性连接肽（linker）：GGSG、GGGGS 等不同长度的连接肽可供选择，用于在空间上隔开标签与目的蛋白，避免空间位阻与折叠干扰。 SL2：线虫双顺反子表达间隔序列，置于两个编码序列之间，可实现单个启动子驱动两个独立蛋白的表达。 PH 结构域：膜定位靶向片段，可使融合蛋白锚定至细胞膜，实现亚细胞定位标记。 二、不同实验目的下，该如何选择插入序列？ 例1、基础启动子活性报告与单基因常规荧光示踪（新手 / 常规实验） 首选：mNeonGreen、sfGFP、EGFP——亮度高、折叠快，在线虫表皮、肌肉与神经等组织中通用性好；建议选择带内含子的版本，体内表达更稳定。 备选：常规 GFP。建议使用含内含子的GFP编码序列用于线虫体内稳定株构建）。 注意事项：不建议选用未经密码子优化、不含内含子的GFP 序列，否则在线虫转基因体系中易发生表达量低甚至不表达 例2、长时程活体成像与重复采集（抗光漂白优先） 首选：mStayGold / StayGold——新一代高稳定性绿色荧光蛋白，弱光条件下长时间成像几乎不发生光漂白，适合胚胎发育、细胞迁移等长时程观察实验。 备选：mNeonGreen v2——亮度更高，抗光漂白性能优于常规 GFP。 例3、多色共定位与多基因同时标记（双色 / 三色标记） 核心原则：选择发射光谱充分分离的荧光蛋白组合，从源头避免通道间串色； 神经多通道三色标记：mTagBFP2（蓝）+ mNeonGreen（绿）+ mScarlet3（红） 常规红绿双标：GFP 系列 + wrmScarlet/mCherry 橙绿搭配：CemOrange2 + sfGFP 注意事项：YFP/Venus 与 GFP 的发射光谱高度重叠，不建议共标；多色标记应优先选用单体荧光蛋白，避免多聚体荧光蛋白引起的错误聚集。 例4、低丰度蛋白荧光示踪 首选：wrmScarlet11×3 红色荧光拆分系统，——线虫组织自发荧光干扰更低、背景更干净，互作信号的信噪比高。 备选：GFP1-10 + GFP11×7 绿色荧光拆分系统，将GFP11×7连接在低丰度蛋白编码序列的N端或C端。 例5、神经元钙活动动态成像 例6、邻近标记辅助的互作蛋白质谱筛选 首选：TurboID（带内含子）——线虫体内生物素标记活性高，短时间内即可完成标记，利于捕捉瞬时互作。 低背景慢速标记首选：UltraID——标记背景更低，适合捕获弱相互作用蛋白。 例7、活体长效追踪与多重化学染色 例8、条件性蛋白敲低与反向遗传学研究 三、常见问题 Q1：带合成内含子和无内含子的荧光蛋白，该怎么选？ A：取决于实验用途： 构建线虫体内稳定表达的转基因株系，应选择带合成内含子的版本——内含子可显著提升线虫体内的表达水平，并降低转基因沉默风险； 进行体外转录、瞬时表达或原核表达，则应选择无内含子的 cDNA 版本，避免原核系统因无法剪接内含子而出现表达异常。 Q2：荧光蛋白和标签融合，是否影响目标蛋白的功能？ A：多数情况下影响有限。首先在选择插入位置前，先进行蛋白结构预测，避免在重要结构域附近进行大片段插入；推荐使用 linker 序列（GGSG、GGGGS 等）一定程度上在空间上隔开标签与目标蛋白，减少空间位阻对折叠的干扰；同时建议优先选用单体荧光蛋白，防止荧光蛋白多聚化引起的蛋白聚集与定位异常。 Q3：敲入后荧光信号弱，如何排查？ A：若荧光蛋白敲入后出现信号弱甚至完全不可见的情况，通常可从以下方面排查：① 荧光观察时间点与目标蛋白的发育时序表达窗口是否匹配；② 蛋白表达水平是否低于荧光显微镜的检测阈值；③ 融合蛋白折叠异常或标签影响了蛋白的稳定性。详细分析与解决方案可参考上源生科往期公众号文章（https://mp.weixin.qq.com/s/32fpPPOdO6jMX_MaK5caUw） Q4：敲入后线虫无法纯合，怎么解决？ A：多数是因为敲入的标签比较大，因为位阻影响了目的蛋白的折叠从而导致目的蛋白功能缺陷。首先排除插入位置附近有重要结构域外；其次可以选用小的免疫标签代替大的蛋白标签，减少位阻对折叠的影响；或者将原荧光蛋白拆分成两部分，只敲入类似GFP11的小肽段减少位阻。 四、适用性声明 秀丽线虫蛋白标记实验的结果，受具体基因位点、实验体系、虫株背景与操作细节等多重变量共同影响。本文关于荧光蛋白与标签选择的内容，均为行业经验科普与知识分享，不构成对任何具体实验操作的确定性指导，亦不对实验结果作任何承诺。 撰稿：袁巧红 审核：赵培 编辑：蔡晨星 关注“上源生科”了解更多
