用线虫解锁抗神经元衰老之法

我们知道衰老有九个生物学特征：基因组不稳定、端粒磨损、表观遗传改变、蛋白酶沉积剂的丧失、线粒体功能障碍、细胞衰老、营养感知失调、干细胞衰竭和细胞间通讯的改变。神经元老化是一种缓慢的渐进变化，人类需要几十年（平均寿命70至80岁），啮齿动物需要数月（平均寿命2至3年），秀丽隐杆线虫需要1至2周（平均寿命2至3周）。衰老被认为是大多数神经退行性疾病的主要危险因素，包括阿尔茨海默病（AD）和帕金森病（PD）。据统计，大于65岁的人群中每10人就有1人患有AD，其患病率随着年龄的增长而持续增加。然而，对于与衰老相关的神经退行性疾病，目前几乎没有有效的治疗方法。因此，我们迫切需要了解神经元老化及与衰老相关的神经退行性病变的分子机制。

在神经元老化过程中，蛋白质谱的变化起到了关键作用。在过去的十年里，对不同模式生物衰老过程中mRNA谱变化的研究揭示了衰老如何影响神经元中的基因表达。然而，新出现的证据表明，mRNA水平并不总是与蛋白质水平相关，而且在某些情况下，mRNA和蛋白质水平可能是独立的。因此，要充分了解神经元的老化，揭示神经元中蛋白质组学水平的变化是很重要的。

2022年12月发表在SCIENCE ADVANCES杂志上的文章“GABA signaling triggered by TMC-1/Tmc delays neuronal aging by inhibiting the PKC pathway in C. elegans”给我们展示了TMC-1蛋白的奇妙之处。

TurboID作为一种生物素连接酶，它可以将生物素标记在与其邻近的亲核氨基酸上，如赖氨酸。人们通常将TurboID连接到感兴趣的蛋白质上来识别蛋白质之间的相互作用。为了检测线虫神经元的蛋白质组学特征，作者构建了TurboID表达的转基因线虫（如图1），随后给转基因线虫饲喂E. coli strain MG1655（生物素缺陷型菌株），并在样品采集前8小时，给线虫补充300 μM生物素，在25℃培养条件下能有效诱导神经元蛋白的标记。

图1  表达TurboID线虫株及用抗HA抗体进行免疫染色后HA-TurboID的分布

作者利用该系统在不同年龄线虫的每个神经元标记样本中鉴定出大约1700-1800个蛋白质，并比较了不同年龄线虫的每种蛋白质水平与成年第一天线虫的蛋白质水平，发现蛋白质组学谱存在年龄依赖性的变化（见图2），并且与翻译机制相关的蛋白质，如核糖体蛋白，在衰老过程中显著下调，而参与囊泡运输和释放调控的蛋白显著上调，提示囊泡相关功能的激活可能参与了神经元的衰老。

图2  线虫不同年龄蛋白质水平变化，其中绿色圆点代表TMC-1

log2FC > 0.6 且–log10(P value) > 1.3 为蛋白质水平显著上调（红色）

log2FC<- 0.6 且–log10(P value) > 1.3 为蛋白质水平显著下降（蓝色）

基于PVD，PLM，ALM这3种神经元具有不同的形态、功能，并由不同的谱系产生。作者在水平上调的蛋白中选择23个功能保守的蛋白进行更深入的功能检测，结果发现，一种蛋白质在神经元衰老中的功能可能因神经元类型的不同而不同，但是TMC-1/Tmc在所有三种类型的神经元中都具有抗衰老的功能（见图3）。通过后续实验，进一步证实了该结论（见图4）。与同年龄野生型线虫的比较可知，tmc-1（ok1859）和tmc-1（OE）分别导致早发性和晚发性衰老相关的PVD神经退行性病变。

图3 不同类型神经元中的蛋白功能

图4 在TMC-1敲除/过表达线虫中PVD神经元产生退行性变性的比例

在大脑中，GABA作为主要的抑制性神经递质发挥着深远的作用，与其他在大脑中表达水平相对较低的神经传递物不同，GABA在哺乳动物的中枢神经系统中含量丰富。根据GABA能神经元和GABA受体的完整图谱，对线虫的研究表明，GABA能神经元占神经元总数的10%，而GABA受体却在近90%的神经元中表达。

在GABA能神经元中表达TMC-1介导γ-氨基丁酸（GABA）的释放，当GABA与代谢型GABA_B受体GBB-1结合后，激活异三聚体鸟嘌呤核苷酸结合蛋白（G蛋白）GOA-1/Goα，从而抑制蛋白激酶C（PKC）通路，保护神经元免受衰老相关的变性和功能衰退（见图5）。由于实验中检测的大多数神经元（如PVD神经元）没有来自GABA能神经元的直接输入，研究结果强调了突触外GABA在神经元衰老中的关键作用。

图5  TMC-1–GABA–PKC信号通路的线虫模型

在人类大脑中，整体的GABA水平随着年龄的增长而下降，而这种与衰老相关的GABA下降与老年人的运动、视觉和认知能力的退化密切相关。由于tmc-1在神经系统中广泛表达，并保护PVD神经元免受神经元衰老，那么TMC-1-GABA-PKC信号轴是否可能是一个更普遍的神经元衰老调节因子呢？

作者比较了tmc-1（lf）和tmc-1（OE）线虫的运动功能，对照组线虫的运动能力表现出了年龄依赖性的下降，第9天的成年线虫仅表现出第1天线虫运动能力的20-30%。过表达tmc-1显著抑制了老年线虫的运动能力下降，且tmc-1（OE）第9天成虫的平均速度是同年龄对照线虫的两倍以上。rab-3（lf）和gbb-1（lf）突变体分别破坏了突触囊泡释放和代谢型GABA受体，rab-3或gbb-1功能的丧失消除了tmc-1过表达对衰老相关运动衰退的保护作用（见图6）。

图6  TMC-1-GABA-PKC信号通路对运动性能的作用

衰老不仅会导致神经退行性变和功能衰退，还会影响神经元对损伤的反应。最近的研究表明，与年轻动物相比，老年动物在轴突切开术后表现出较弱的轴突再生。线虫的PLM神经元表现出与衰老相关的轴突再生的显著下降。因此，作者利用轴突切开术，观察术后24小时内PLM轴突再生情况（见图7）。实验表明tmc-1（OE）显著提高了第5天线虫的轴突再生能力，这一作用是由于抑制了与衰老相关的轴突再生下降，而不是促进轴突再生。

图7  TMC-1-GABA-PKC信号通路对PLM神经元轴突再生的影响（红色箭头表示轴突切开位点）

作者上述的实验表明在正常生理情况下，TMC-1对神经元的保护作用。那么在疾病情况下，它是否也能发挥相同功能呢？于是，作者在构建的过表达人类Tau蛋白线虫中进行了测试。过表达TMC-1或巴氯芬处理线虫，都能够激活TMC-1-GABA-PKC信号轴，抑制与衰老相关的自噬或线粒体自噬的增加，从而发挥神经保护功能（见图8）。

图8  TMC-1-GABA-PKC信号通路对AD模型线虫的运动性能的作用