以秀丽线虫为研究对象在长寿条件下揭示溶酶体蛋白组异质性

生物组学研究是对生物体生命活动规律的一种全局研究，即从整体上研究一个生物体、一个细胞或一个组织的某种分子所有组成内容，例如DNA、RNA、蛋白质、代谢物等，分别对应着基因组学（Genomics）、转录组学（Transcriptomics）、蛋白质组学（Proteomics）和代谢组学（Metabolomics）等领域。

基因组学是研究染色体DNA序列及其组成、结构、功能和演化等的学科。

转录组学是研究生物体内转录过程的学科，主要研究生物体内基因表达的情况。

蛋白质组学是研究生物体内蛋白质组成和功能的学科，涉及蛋白质的表达水平、翻译后修饰情况和蛋白质间的相互作用等。

代谢组学则研究生物体、细胞或组织中的小分子物质，包括代谢物的鉴定、表达水平分析及其相互作用分析等。

生物组学研究通过收集和分析大量生物学数据，研究生物组织或个体的全局性特征和相互作用，并在此基础上研究其生物学机制和疾病发生的原因与治疗方法。下面就由小编为大家解读一篇贝勒医学院Meng Wang研究团队发表于eLife上的关于线虫溶酶体蛋白组在衰老方面的研究成果。

溶酶体是在细胞质中构成酸性特殊环境的膜细胞器。溶酶体内含有维持其活性的多种必需蛋白，并介导溶酶体调节效应。在溶酶体腔内部，存在着一系列酸性水解酶，例如脂酶、蛋白酶、葡糖苷酶、酸性磷酸酶、核酸酶和硫酸酯酶等。这些酶负责降解及循环再利用通过胞吞、吞噬和自噬作用过程运输的胞外和胞内物质。另外，位于溶酶体膜上，有一组嵌入的跨膜蛋白在稳定溶酶体腔酸性pH和离子稳态功能、控制溶酶体膜电位、代谢产物输出、调节细胞器相互作用以及信号转导方面发挥着重要作用。例如，在溶酶体膜上的v-ATPase是溶酶体腔内质子积累的主要驱动器，同时还需要由离子通道和转运蛋白调节的中和离子运动。另外，依靠氨基酸和脂质信号，v-ATPase与溶酶体氨基酸转运蛋白SLC38A9以及溶酶体胆固醇输出蛋白NPC1协同调节mTORC1活性。mTORC1通过RagA/B和RagC/D GTPase异二聚体被招募到溶酶体上，这个过程与锚定在溶酶体膜上的支架蛋白复合物Ragulator有关。Ragulator通过与Axin相互作用，同时调节在溶酶体表面的AMPK活性。更进一步地，溶酶体并非静态、孤立的细胞器，相反，它们是在顺式（细胞核到外周）及反式（外周到细胞核）方向高频转运的活动囊泡，并以此形成与包括核内体、自噬体、内质网和线粒体在内的其他细胞器的动态相互作用。这些运输和相互作用过程是由溶酶体上嵌入的跨膜蛋白和多种蛋白调节的，相关蛋白被招募到溶酶体以对胞外和胞内信号做出反馈。

溶酶体控制着大量的细胞进程，其功能紊乱与多种疾病有关，例如溶酶体贮积病（lysosomal storage disorders）、阿尔兹海默病、帕金森病和一些类型癌症。有大量的研究证据表明，溶酶体通过参与自噬和调节代谢信号路径，在生物体长寿中发挥中枢调节者的作用。在多个促长寿状态中可以观察到被诱导自噬流形成，这对于由遗传、饮食和药物干预引起的长寿效果是必须的。另一方面，溶酶体被认为是调节mTORC1和AMPK活性的关键平台，而上述两者是具有明确的长寿调节路径。鉴于溶酶体在长寿调控中的重要性，了解溶酶体蛋白质组成的变化如何与长寿调控相关至关重要。

为了系统性地解析溶酶体蛋白组成图谱，首先需要从细胞中分离出溶酶体。有两种分离溶酶体的方法：梯度离心和溶酶体免疫沉淀法。文章中作者采用免疫沉淀法快速从转基因线虫中分离出溶酶体，该转基因线虫表达含有3×HA标签的溶酶体膜蛋白LMP-1（Lyso-Tag）。接着使用与抗体结合的磁珠从细胞破碎液中吸附出溶酶体。该快速分离方法促进后续使用基于质谱（MS）的蛋白质组学和代谢组学的分析（图1）。【使用相类似的原理，也可以从细胞中分离出其他有膜细胞器，例如线粒体，内质网等】

图1  Lyso-IP的技术流程

使用溶酶体探针（Lysotracker）与表达LMP-1-RFP的转基因线虫能很好地重合。利用不同抗体【HSP-60（线粒体），CYP-33E1（内质网），SQV-8（高尔基体），β-actin（细胞质）】能从破碎的沉淀颗粒（Pellet）、分离上清液（Flow-through）和纯化溶酶体（Lyso-IP）成分中验证不同的细胞器或成分，说明该方法能有效地富集溶酶体及其蛋白。并且四个独立的蛋白组图谱主成分分析（PCA）表明，该方法分离的溶酶体蛋白具有很高的重现性（图2）。

图2  Lyso-Tag方法具有良好的重现性

基于溶酶体蛋白组数据，作者从被检测到的6000个蛋白中得到216个候选的溶酶体富集蛋白，其中包含有178个候选蛋白与哺乳动物相关蛋白具有同源性。候选的溶酶体蛋白中包含83种膜转运和通道蛋白、47种酶、26种信号因子、12种结构成分和6种涉及囊泡运输蛋白。上面介绍中我们提到溶酶体膜上的v-ATPase，它是由两个V0和V1可逆解聚的亚单元结构域组成的，通过分析两个亚单位中各种蛋白的在Lyso-IP和Flow-through中的相对成分差异进一步说明系统性富集的溶酶体蛋白组图谱具有良好的代表性（图3）。

图3  Lyso-IP富集的蛋白具有良好的代表性

由于溶酶体的尺寸大小、形状、pH和细胞分布的差异性而被公认为是一种异质性的囊泡成分。溶酶体广泛存在于生物体的不同组织中，并按照组织特异性的方式发挥不同作用。为了验证上述观点，作者使用组织特异性的启动子unc-119（神经元）、myo-3（肌肉）、ges-1（肠道）和col-12（真皮）过表达LMP-1 Lyso-Tag，并纯化分析不同组织溶酶体蛋白组异质性。上述中我们提到216个溶酶体富集的候选蛋白（whole-body Lyso-IP），其中85个与组织特异性溶酶体蛋白组（tissue-specific Lyso-IP）没有显著差异（Group I），56个蛋白在tissue-specific Lyso-IP中显著增加丰度（Group II），66个蛋白在tissue-specific Lyso-IP中显示降低丰度（Group III），并有其中9个蛋白在tissue-specific Lyso-IP完全不存在（Group IV）。这些结果充分展示了生物体溶酶体蛋白组在不同组织间的异质性（图4），这可能与不同组织的代谢状态有关，其产生的结果是特异性激活组织信号的效果。

图4  不同组织溶酶体蛋白组图谱具有异质性

基于溶酶体作为整合蛋白质信号和调节寿命的细胞枢纽作用，那么溶酶体蛋白质成分所展示出的异质性是否与不同的长寿机制相关呢？围绕着这个问题，作者通过杂交构建多种不同长寿机制的表达LMP-1 Lyso-Tag线虫品系：lipl-4转基因品系（lipl-4 Tg，即组成型表达溶酶体酸脂肪酶），功能缺失的daf-2突变体（daf-2(lf)，即胰岛素受体信号通路），功能缺失isp-1突变体（isp-1(lf)，即线粒体电子转移信号通路），功能缺失glp-1突变体（glp-1(lf)，即温度敏感型的性腺功能缺陷）。通过比较上述四株线虫与野生型的溶酶体蛋白组差异性（图5），表明不同的长寿机制以其特殊的方式影响溶酶体蛋白成分。

图5  不同的长寿机制中溶酶体中所含蛋白的差异性

在lipl-4 Tg，daf-2(lf)，和glp-1(lf)的溶酶体富集蛋白组中，作者发现细胞自噬小体相关蛋白，而这些诱导自噬蛋白具有延长寿命的作用。另外，我们前文中介绍 Ragulator复合物，它作为支架蛋白可激活AMPK和mTORC1的活性，相对于野生型，Ragulator复合物在lipl-4 Tg中具有更高的丰度（图6）。而相关的成分在daf-2(lf)，isp-1(lf)或glp-1(lf)突变体中并没有检测到，这暗示溶酶体可能是招募Ragulator复合物并激活AMPK（aak-1，aak-2）延长lipl-4 Tg线虫寿命的关键因素。为了验证相关的结论，作者使用RNAi调查aak-1，aak-2在lipl-4 Tg中的作用。结果显示AMPK通路缺失能显著降低lipl-4 Tg延长寿命的效果。在lipl-4 Tg中除了Ragulator复合物外，其他蛋白或复合物，例如v-ATPase、溶酶体通道蛋白/转运蛋白、溶酶体水解酶等具有更高的丰度，这有助于调节溶酶体内形成成熟的酸性环境，增加细胞自噬，诱导激活AMPK，最终延长寿命。

图6  lipl-4 Tg中溶酶体增加溶酶体蛋白多样性

已知溶酶体腔内的pH影响其在细胞中的分布，越靠近细胞核的位置，溶酶体表现出越强的酸性。在细胞中，运动的溶酶体会随着不同的营养信号和代谢状态沿着核-外周轴分布。有趣的是，作者在分析lipl-4 Tg溶酶体富集蛋白组时，发现有两个核定位的核孔蛋白（NPP-6，NPP-15），而它们并没有在daf-2(lf)，isp-1(lf)或glp-1(lf)的长寿命突变体中发现。因此作者推测有LIPL-4诱导的溶酶体脂解作用可能增加溶酶体与细胞核之间相互邻近，并增加溶酶体活性。

为了验证上述推测，作者通过荧光成像分析溶酶体的细胞分布，使用LMP-1::RFP标记溶酶体，GFP标记细胞核。结果发现相对于WT，lipl-4 Tg的分布更接近于细胞核外周，这种现象在同样是长寿线虫的daf-2(lf)中并没有观察到。更进一步地，作者使用RNAi分别敲降lipl-4 Tg和daf-2(lf)中的NPP-6蛋白，发现只有在lipl-4 Tg中线虫的寿命才受到显著的影响。这说明了增加溶酶体和细胞核的邻近可能促进lipl-4 Tg诱导的长寿效果（图7）。

图7  lipl-4 Tg中溶酶体-细胞核临近增强长寿效果

为了分析lipl-4 Tg线虫中lipl-4对成熟溶酶体成分的影响，作者选择CTNS-1（溶酶体半胱氨酸转运蛋白Cystinosin）标记成熟溶酶体。首先作者分别通过wrmScarlet和mNeonGreen荧光蛋白基因编辑内源性的CTNS-1和LMP-1位点，发现他们在多个组织中仅有部分重合。接着，作者也像LMP-1 Lyso-Tag一样，构建CTNS-1 Lyso-Tag线虫，通过RFP和Lysotracker共定位信息确认CTNS-1定位于溶酶体。使用与LMP-1 Lyso-IP相同的方法，作者利用CTNS-1 Lyso-IP鉴定了293个候选的溶酶体蛋白（LMP-1 Lyso-IP是216个）。这些蛋白中有95个是与LMP-1 Lyso-IP共享的蛋白，其中的47个是有溶酶体定位注释的。在野生型线虫中，比较LMP-1 Lyso-IP和CTNS-1 Lyso-IP中，专属于LMP-1 Lyso-IP部分（121个）有8个携带有溶酶体注释（占比7%），而专属于CTNS-1 Lyso-IP部分（198个）有35个携带有溶酶体注释（占比35%）（图8）。

专属于CTNS-1 Lyso-IP部分（198个）蛋白中，自噬体蛋白和调节mTORC1的Ragulator复合物展现出更高的丰度。为了验证Lyso-IP结果，作者还使用基因编辑在 LMTR-3（Ragulator复合物成分）原位敲入wrmScarlet，发现在多个组织中LMTR-3::wrmScarlet与CTNS-1::mNeonGeen的重叠率要显著高于LMP-1::mNeonGeen，这进一步印证了Lyso-IP的结果。进一步的系统性分析显示，基于同源性得到的85个溶酶体相关蛋白中，有63个在蛋白组图谱中检测到。其中有许多溶酶体水解酶在CTNS-1 Lyso-IP中的丰度显著增加，这与lipl-4 Tg的LMP-1 Lyso-IP的趋势是一致的，这一现象愈加支持长寿命线虫lipl-4 Tg携带有更多酸性溶酶体这一推断。

图8  CTNS-1 Lyso-Tag富集的溶酶体蛋白组

为了理解本文章中鉴定的新溶酶体富集蛋白在调节溶酶体功能方面的作用，作者使用RNAi方法就LysoSensor（DND-189溶酶体绿色荧光探针）荧光密度参数判断它们在溶酶体中的效果。作者将注意力集中在LMP-1和CTNS-1 Lyso-IPs中富集的95个共有蛋白，并对它们的编码基因进行RNAi。结果显示有五个基因在KD中引起LysoSensor信号密度变化，其中有四个具有人源的同源物。进一步检查其对溶酶体数量、尺寸和pH方面的影响可以发现，RNAi KD两个溶酶体v-ATPase亚基（UNC-32和VHA-5）导致降低溶酶体数量，但增加溶酶体尺寸。作者同时使用荧光寿命显微镜衡量LysoSensor的荧光寿命，因为LysoSensor的荧光寿命与溶酶体pH值呈负相关性。令人意外的是，unc-32 KD增加LysoSensor的荧光寿命，这意味着溶酶体的pH值降低了，这可能是对unc-32 KD后溶酶体数量降低40%表型的补偿作用。总的来说，unc-32失活会损害溶酶体v-ATPase功能，并导致溶酶体成熟缺陷。作者对另一个蛋白R144.6进行mNeonGreen的原位敲入。R144.6 KD不影响溶酶体的数量和尺寸，但是增加溶酶体pH。作者发现R144.6::mNeonGreen荧光与LysoTracker信号重叠，进一步支持Lyso-IP中关于R144.6定位于溶酶体的结论。R144.6并没有在肌肉和肠道中表达，因此在上述两个组织中mNeonGreen与LysoTracker并不重叠，这一组织特异性Lyso-IP结构是一致的，即并没有在肌肉和肠道组织的Lyso-IP检测到R144.6（图9）。

图9  新的溶酶体富集蛋白调节溶酶体功能

在生物体中影响衰老的机制错综复杂，在细胞中形成一个复杂的网络。在这个复杂的网络中如何减少“生成”，或增加“降解”，又或是在两者之间维持一个动态平衡可能决定了生物体衰老的趋势。本文中作者将衰老研究关注在溶酶体这一细胞“降解”关键细胞器，为我们长寿研究指明新的可能。另外，上源生科也为本文章提供专业的基因编辑服务（图10），助力衰老研究，让我们一起为人类生存健康共同努力！

图10  上源生科为该研究提供的基因编辑服务